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东北农业大学大豆研究所生物技术应用研究进展情况

东北农业大学大豆研究所生物技术应用研究进展情况. 陈庆山、李文滨. 东北农业大学大豆研究所 中国 · 哈尔滨. 东北农业大学大豆研究所生物技术研究概况. 大豆遗传图谱构建 大豆功能基因分离与鉴定 抗病基因分子标记 重要农艺性状 QTL 分析 大豆 SMV 抗病相关表达谱分析 大豆功能基因转化研究 大豆资源分析. 一、大豆遗传图谱构建. 1.1 材料与方法. 群体构建 Charleston × 东农 594 F2:10 RIL 154 SSR 分析 大豆总 DNA 的提取 SSR 引物 ----- SOYBASE

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东北农业大学大豆研究所生物技术应用研究进展情况

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  1. 东北农业大学大豆研究所生物技术应用研究进展情况东北农业大学大豆研究所生物技术应用研究进展情况 陈庆山、李文滨 东北农业大学大豆研究所 中国 ·哈尔滨

  2. 东北农业大学大豆研究所生物技术研究概况 • 大豆遗传图谱构建 • 大豆功能基因分离与鉴定 • 抗病基因分子标记 • 重要农艺性状QTL分析 • 大豆SMV抗病相关表达谱分析 • 大豆功能基因转化研究 • 大豆资源分析

  3. 一、大豆遗传图谱构建

  4. 1.1 材料与方法 • 群体构建 Charleston ×东农594F2:10RIL 154 • SSR分析 大豆总DNA的提取 SSR引物----- SOYBASE 引物扩增 数据统计及分析 遗传作图 Mapmaker/EXP3.0 /MapChart 2.1 MSD

  5. 1.2 研究结果——SSR引物及位点评价 • SSR引物扩增结果分析 500对----绝大多数有稳定扩增产物 194对----有多态 多态率为38.8%。 164对----群体扩增 大多数产物只有一个片段，以引物名命名其座位名称 • SSR位点在RILs株系中的分布 161 SSR----整合到遗传图谱 89 （55.28%）SSR引物----符合1:1分离比 72 （44.72%）SSR引物---偏分离 原因：一些引物在143个RILs群体中缺失较多 一些RILs位点杂合个数较多 >15个sat_091、satt009、satt012、satt584、satt521 重组自交系材料构建过程可能导致偏分离的产生

  6. 研究结果——RIL群体株系的评价 • RIL群体遗传结构分析 群体的遗传结构----各株系亲本的基因型组成 父母本对群体总体及各株系的遗传贡献率 东农594----平均遗传贡献率为46%，对各株系分布在14-80% Charleston----平均遗传贡献率为53%，对各株系分布在20-86% • RILs群体株系评价 各株系的多样性指数（SHANNON）均值为4.93，分布在4.56-5.06，比较接近完全平衡时的5.04 平均遗传相似系数为0.892，0.682-0.997，部分集中在0.95-0.98

  7. 研究结果——遗传图谱构建 • 大豆遗传图谱NEAUSRI — GMS 1913.5cM 20连锁群 161 SSR 标记间平均距离为11.89cM 每个连锁群长度变动在0.4cM-309.5cM之间 连锁群上的标记数在2-28个之间

  8. GM19-N GM20-O

  9. 与国内外图谱比较 • NEAUSRI遗传图谱 97/161 SSR引物与国内外对应连锁群上的相同引物对应 对应引物从GM2-A2、GM13-H、GM18-M的1个到GM7-D1a 12个 平均配对个数为4.85个 对应个数少的连锁群主要是本研究中SSR引物较少的几个连锁群

  10. 二、大豆功能基因分离与鉴定 • 大豆抗病相关基因的分离与鉴定 • 大豆其它基因的分离

  11. 2.1 大豆抗病相关基因的分离与鉴定 2.1.1 研究方法 Total RNA提取 接种样品 取 样 RGA扩增与克隆 RGA产物测序与鉴定 种植绥农10 疫霉根腐病菌培养 全长基因获得――RACE方法 大豆SR1基因的斑点杂交和Southern杂交 大豆SR1的转录表达检测

  12. 2.1.2 研究结果—抗病基因同源序列的获得 RT-PCR扩增结果 RT-PCR扩增大豆抗病基因同源序列 提取绥农10号叶片总RNA M 1 2 RT-PCR 1 2 3 4 28S 18S Degenerate oligonucleotide primers designed according to N and RPS2 and L6 P1-P3 cDNA from Suinong 10 500bp 泳道1~4分别为接种后24、36、48、60h取样提取的绥农10号叶片总RNA M：DL2000 marker，1：RT-PCR扩增片断，2：CK

  13. 目的cDNA片段的克隆及鉴定 克隆的鉴定-蓝白斑筛选 1 2 3 1：转化后的大肠杆菌DH5α在100mg/ml Amp的LB培养基的生长；2：未转化的DH5α在100mg/ml Amp的LB培养基的生长；3：未转化的DH5α在无Amp的LB培养基的生长

  14. 克隆的鉴定-质粒酶切 M1 1 2 3 4 5 6 7 M2 3.0kb 500bp M1：λ-EcoT14I marker；1~7：转化后质粒EcoRI酶切；M2：DL2000 marker 质粒酶切鉴定PCR产物的插入 送交5个测序，有两个通读

  15. SR1全长cDNA的获得 5´RACE的扩增结果——以RNEAU-1为耙序列 M 1 2 900bp M：DL2000 marker，1：巢式PCR扩增产物，2：第一次PCR产物

  16. 3'RACE扩增结果 M 1 2 2.5kb M：λ-EcoT14I marker，1：巢式PCR产物，2：第一次PCR产物

  17. 5'RACE和3'RACE与靶序列RNEAU-1的拼接 将5'RACE序列、3'RACE序列与靶序列RNEAU-1进行了拼接，得到3574bp的拼接序列。

  18. 全长cDNA序列的获得 M 1 3.5kb M：λ-EcoT14I marker，1：RT-PCR扩增产物

  19. 全基因测序 • 3574bp全长cDNA序列 3411bp的开放读码框 72bp的5'非翻译区 68bp的3'非翻译区 20bp的多聚腺苷酸尾 • 73bp ATG起始密码子，3484bp TAA终止密码子 • 编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列 • 该基因被命名为SR1 • GenBank 注册号：AY193892

  20. 大豆SR1基因编码蛋白质产物的结构分析 1 MAATTRSLAS IYDVFLSFTGQDTRHGFTGYLYKALDDRGIYTFIDDQELPRGDEIKPALS 61DAIQGSRIAITVLSQNYAFSTFCLDELVTILHCKSEGLLVIPVFYKVDPSHVRHQKGSYG 121EAMAKHQKRFKANKEKLQKWRMALQQVADLSGYHFKDGDA YEYKFIQSIV EQVSREINRA 181 PLHVADYPVG LGSQVIEVRK LLDVGSDDVV HIIGIHGMGGLGKTTLAVAV YNLIAPHFDE 241 SCFLQNVREE SNLKHLQSSL LSKLLGEKDI TLTSWQEGAS MIQHRLRRKK VLLILDDVDK 301 REQLKAIVGK PDWFGPGSRVIITTRDKHLL KYHEVERTYE VKVLNHNAAL HLLTWNAFKR 361 EKIDPIYDDV LNRVVTYASGLPLALEVIGS NLYGKTVAEW ESALETYKRI PSNEILKILQ 421 VSFDALEEEQ QNVFLDIACC FKGHEWTEVD DIFRALYGNG KKYHIGVLVE KSLIKYNRNN 481 RGTVQMHNLI QDMGREIERQ RSPEEPGKRK RLWSPKDIIQ VLKHNTGTSK IEIICLDSSI 541 SDKEETVEWN ENAFMKMENL KILIIRNGKF SIGPNYIPEG LRVLEWHRYP SNCLPSNFDP 601 INLVICKLPD SSITSFEFHG SSKKLGHLTVLNFDKCKFLT QIPDVSDLPNLKELSFRKCE 661SLVAVDDSVG FLNKLKKLSAYGCRKLTSFP PLNLTSLRRLQISGCSSLEY FPEILGEMVK 721 IRVLELHDLP IKELPFSFQN LIGLSRLYLR RCRIVQLRCS LAMMSKLSVF RIENCNKWHW 781 VESEEGEETV GALWWRPEFS AKNCNLCDDF FLTGFKRFAH VGYLNLSGNN FTILPEFFKE 841LKFLRTLDVSDCEHLQKIRG LPPNLKDFRA INCASLTSSS KSMLLNQELY EAGGTKFMFP 901 GTRIPEWFNQ QSSGHSSSFW FRNKFPAKLL CLLIAPVSVP LYSLFPPKVS FGHHVPYPKV 961 FINGKCQAFW GCHWKQRMME LDHTYIFDLQ KLPFENDNLF EEGAWEEEWN HVEVRYESVL 1021 ELESSLIKGS GIHIFREEGS MEEDIRFDDP YLSSSASESR TEEDIRFDDP YLSSSASESS 1081 TEEDIGFDDP YLSSSASESP SFLQTIALGT RKFSIAFFLF FSCFLFYYFG FSCKKFT 1137 aa TIR：红色划线区 NBS：蓝色划线区 LRR：黑色划线区 HD：疏水结构域，也称功能未知保守结构域1（绿色划线区） Conserved Domain 2: 功能未知保守结构域2（粉色划线区）

  21. 1 2 3 4 5 6 7 8 1：λ-DNA/HindIII+EcoRI marker；2：阳性对照；3-8：绥农10基因组DNA用HindIII、BamHI、EcoRI、EcoRV、DraI和TaqI酶切后与探针的杂交 SR1基因的斑点杂交和Southern blot分析 1 2 1：对照，SR1基因自身的杂交；2：SR1基因与绥农10号基因组的杂交

  22. M 1 2 3 4 5 6 7 3.5kb M：λ-EcoT14I marker，1：未接种时取样的RT-PCR，2-7：接种后12、24、36、48、60、72h取样的RT-PCR 大豆SR1的转录表达研究 大豆SR1的器官特异性检测 接种大豆疫霉根腐病菌对SR1表达的影响 M L R S M：λ-EcoT14I marker，L、R、S：分别代表SR1在大豆叶片、根和茎中的RT-PCR扩增

  23. 大豆SR1的转录表达研究 水杨酸对SR1表达的影响 M 1 2 3 4 5 6 7 3.5kb M：λ-EcoT14I marker，1：未喷洒水杨酸时取样的RT-PCR，2~7：喷洒水杨酸后12、24、36、38、60、72h取样的RT-PCR

  24. 扩增产物的克隆 M：λ-EcoT14I marker，1~5:重组质粒NotI酶切 转化后重组质粒的酶切 绥农10号基因组的克隆 基因组中的扩增 M：λ-EcoT14I marker，1：基因组中的扩增片段 以S1-A1为引物在绥农10基因组中的扩增

  25. 与SR1cDNA序列的比对 测序 测序获得3972bp的DNA序列SR2，序列比对显示SR2基因含有4个内含子

  26. 2.2 大豆其它基因的分离 • 大豆抗逆相关基因延伸因子1A的分离 研究方法 抗SMV品系东农8143 SSH技术 获得片段 RACE技术 得到全长 RT-PCR 基因表达与鉴定 SOUTHERN & NORTHERN

  27. 抗逆相关基因延伸因子1A GenBank 注册号：AY651886         1 ttgagacctg gtgtcttgaa gcctggaatg gtggtgactt ttgcaccaac tggactgaca       61 accgaagtta agtctgtgga aatgcaccat gaagctctca cagaggctct tcccggtgat      121 aatgttggat tcaatgttaa gaatgttgct gttaaggatc tcaagcgtgg ttatgttgcc      181 tcgaactcaa aggatgatcc tgccaaggag gctgctaact tcactgccca ggttatcatc      241 atgaaccatc ctggtcagat tggaaatggc tatgcccctg ttcttgactg ccacacttcc      301 cacattgctg tcaagtttgc tgaactcatg accaagattg acaggcgatc tggcaaagag      361 cttgagaagg aacccaagtt tttgaagaat ggtgatgctg gttttgttaa gatgattccg      421 accaaaccca tggtggttga aactttctct gagtaccccc cacttggtcg ctttgctgtc      481 agggatatgc gtcaaactgt tgctgtggga gtcatcaaga acgtggagaa gaaggatcct      541 actggagcca aggtcaccaa ggctgcccag aagaagaagt gaatcgtgcg gtttggttca      601 tcaggggatg tcgtttctta tggttacaat aaatgttggt ttcttgccct tgtgtcttcg      661 tttctaggta gcttgttttt cggacatagt ttgaagtctc caccatcatc tcgcaacttt      721 tgttcccaga attgggttct tgatcgacgg tggcaagact ccttttatca ttctgtttta      781 atgtgttgtg tttgtgagaa cccctgatta catttttgtt aagcgcagcg agttttaggg      841 ctttgccgtt gcgttgttgg tttgcttctt aaatgtcaac tttatatttg tgttcaattt      901 ttgcttggtt tgcttttaaa aaatcaaatt tatgtgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      961 aaaaa

  28. 0 12 24 36 48 60 72 84 108 132 156 180 204 228 252 EF-1A 40S 抗逆相关基因延伸因子1ART—PCR分析

  29. 三、抗病基因分子标记

  30. 3.1 大豆灰斑病7号生理小种抗病基因分子标记 东农91212（♀）×东农9674（♂） 感灰斑病7号生理小种 抗灰斑病7号生理小种 F2-3 RAPD OPS03 8.7cM 科学通报，1998，12：2302-2307 大豆对灰斑病菌7号小种抗性的遗传分析及抗病基因的RAPD标记 科学通报，1999，23：2544-2550 大豆灰斑病抗病基因RAPD标记的分子特征及抗、感种质的SCAR标记鉴定

  31. 3.2 大豆灰斑病7号生理小种抗病 基因分子标记

  32. 3.2.1 研究方法 材料 东农40566（♀）×东农410（♂） 抗灰斑病8个生理小种 感灰斑病1号生理小种 F2 结合2002年田间抗性接种鉴定结果和2003年盆栽抗性接种鉴定结果-----186个株系 F5

  33. 实验方法 • 大豆灰斑病菌的培养 保存培养----FLS 1号小种 、 PDA培养基、4℃/20天 转接培养----平板PDA培养基、25℃/30天 扩大培养----高粱培养基、25℃/30天 接种培养----毛巾保湿培养、 25℃/7天 • 群体抗性鉴定 群体种植、群体接种、病情调查 • 分子标记分析方法 DNA 提取、抗感池的建立、SSR分析 • 引物筛选分析 PCR反应 、Mapmaker/EXP3.0 、MapChart 2.1

  34. 3.2.2 研究结果—群体抗性鉴定结果分析 卡方检验（χ2=0.9245） 差异不显著，感病：抗病符合1：1

  35. 引物筛选 1：抗亲；2：感亲；3-12建抗池单株；13-22建感池单株 SOYGPATR在小群体上的多态性表现 BSA法寻找SSR引物/500个，10个感病株系的带型与感亲带型完全一致，而抗病株系中有9个与抗亲带型一致，仅有一个株系的带型与抗性鉴定结果不符。

  36. 连锁分析 Satt565

  37. 抗病基因连锁图谱 连锁顺序： Satt565—SOYGPATR—Hrcs1—Satt396 连锁距离： 6.2cM—6.5cM—Hrcs1—14.7cM

  38. 连锁群分析 • 抗FLS 1号生理小种基因 ----SOYGPATR、 Satt565、Satt396位于C1连锁群 与Mian研究的美国Rcs 3 —— J 不同 • 抗病基因成簇分布—— F、G和J • QTL分析抗病存在于各个连锁群---- 大豆只有D1b、J、K、N上无抗SCN基因位点 C1连锁群上有抗SCN RACE 2 和14的位点

  39. 四、大豆主要农艺性状的QTL分析

  40. 研究方法——性状调查 品质性状 • 蛋白质含量：株系混合脱粒后，取50克样品利用Perten8620测得，用百分数表示（％） • 油分含量：株系混合脱粒后，取50克样品利用Perten8620测得，用百分数表示（％） • 蛋脂总量：一个株系的蛋白质含量和油分含量的总和，用百分数表示（％） 产量性状 • 单株荚数：单株全部正常结实的荚数，每一株系考种3株，计算均值 • 单株粒重：单株全部正常结实的粒数，每一株系考种3株，计算均值 • 百粒重：从单株正常结实粒中选取大小均匀的100粒称重，重复2次，计算均值（g） 形态性状 • 株高：在田间调查时，指从地面到主茎顶端生长点的长度 室内考种指从子叶节算起至主茎顶端的实际长度（cm） • 生育期：自大豆播种出苗至正常成熟时的天数（D） • 分枝数：主茎上有效分枝数（有两个节以上并有一节着荚的分枝），分枝上分枝计算在内 • 主茎节数：从子叶节算起，至主茎顶端的实际节数 • 结荚习性：指植株开花结荚状况，分无限（I）、亚有限（S）、有限（D）三类 • 花色 ：指花瓣的颜色，分紫色（P）、白色（W）两类 • 茸毛色：于成熟时调查，分灰色（P）、棕色（B）两类 • 叶形 ：开花盛期植株中上部第8-10节复叶中间小叶的形状。分长叶（L）、圆叶（R） • 平均叶长：植株中上部第8-10节复叶中间小叶的平均叶长（cm） • 平均叶宽：植株中上部第8-10节复叶中间小叶的平均叶宽（cm）

  41. 统计分析 • 利用Windows QTL Cartographer V2.0进行复合区间作图扫描农艺性状的QTLs，以似然比LR（Likehood Ratio）大于11.5，即对应LOD值大于2.5作为QTLs存在阈值 • 利用MapChart 2.1版本绘制连锁图谱

  42. 4.2 研究结果——株系主要农艺性状分离情况 大豆重要农艺性状的QTL分析 —— 一年两点 • 蛋白质含量、油分含量、蛋脂总量、单株荚数、单株粒重、百粒重、结荚习性、茸毛色、叶形、平均叶长等几个农艺性状指标均呈正态分布 • 株高、生育期、主茎节数、花色呈现左偏分布 • 分枝数呈现右偏分布 • 平均叶宽则呈现双峰分布

  43. 品质性状QTL分析

  44. 品质性状——油分含量 Satt094（11.0）- Qsoil 1-（28.2）Satt556 Sat_001（0.0）- Qsoil 2-（7.3）Sat_114 Satt257（17.0）- Qsoil 3-（5.9）Satt551 Satt551（5.0）- Qsoil 4-（18.8）Satt022 LOD值：Qsoil 2（8.21）> Qsoil 1（5.04）> Qsoil 3（4.20）> Qsoil 4（4.08） 加性效应：Qsoil 2（0.52）> Qsoil 1（-0.43）> Qsoil 3（0.32）＝Qsoil 4（0.32） 可解释变异：Qsoil 1（21.98％）> Qsoil 2（18.10％）> Qsoil 3（13.17％）> Qsoil 4（12.73％）

  45. 产量性状QTL分析

  46. 产量性状——单株荚数 Satt334（33.0）- Qsppp 1-（5.4）Satt002 Satt002（2.0）- Qsppp 2-（2.8）Sat_092 Sat_092（4.0）- Qsppp 3-（9.0）Satt460 Satt173（12.0）- Qsppp 4-（3.6）Satt581 LOD值：Qsppp 2（4.53）> Qsppp 3（4.27）> Qsppp 1（3.46）> Qsppp 4（3.30） 加性效应：Qsppp 1（-6.34）> Qsppp 2（-5.78）> Qsppp 3（-5.19）> Qsppp 4（-4.91） 可解释变异：Qsppp 1（12.67％）> Qsppp 2（9.52％）> Qsppp 3（8.94％）> Qsppp 4（8.11％）

  47. 形态性状QTL分析

  48. 形态性状QTL分析

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