Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability

1. Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability David Summers Department of Genetics, Downing Street, Cambridge, UK

2. wie wird die Kopienzahl reguliert? wie werden Multimere aufgelöst? Ausgangssituation • multicopy plasmide werden bei der Zellteilung zufällig auf die Tochterzellen übertragen • natürliche Plasmide sind extrem stabil hinsichtlich ihrer Kopienzahl • künstliche Vektoren (pUC-Reihe) gehen unter nicht-selektiven Bedingungen schnell verloren • multicopy-plasmide können durch Rekombination leicht multimerisieren Fragen: Bekannt ist:

3. Modelle zur Kontrolle der Kopienzahl Sufenmodell: hohe Replikationsrate bis zum Sollwert, dann kompletter Stop Exponentielle Kinetik: Mittelwert Hyperbolische Kinetik: umgekehrte Proportionalität zw.Kopienzahl und Replikationsrate

4. Replikationskontrolle des Plasmids ColE1 • RNAII Präprimertranskript wird transkribiert • hybridisiert am OriV • Spaltung durch RNAse H • Spaltprodukt bildet Replikationsprimer • Replikation startet

5. Replikationskontrolle des Plasmids ColE1 • RNAI-Repressortranskript interagiert mit RNAII • Veränderte Faltung der RNA • keine Primerbildung, keine Transkription

6. Bereits kleiner Anteil an Dimeren wirkt sich aus Chance, dass plasmidfreie Zellen entstehen Dimer hat doppelte Chance, repliziert zu werden Dimere verdrängen Monomere Dimer Katastrophe Folgen der Plasmid-Multimerisierung • Aber: Zellen mit Multimeren wachsen langsamer

7. Auflösung von Plamid-Multimeren • Replikationsstellen auf Plasmiden: • cer-site aus 240 Bp • Bindestelle für XerC- und XerD-Rekobinase • Weitere Proteine: ArgR und PepA • Rekombination an cer folgt topologischem Zwang • XerCD könnte in cis und in trans rekombinieren Topologischer Zwang muss von anderen Proteinen stammen

8. ArgR bildet in Gegenwart von Arginin eine Hexamer • enthält DNA-Bindedomäne • bindet an ARG-Boxen (z.B. cer-site) • biegt DNA um 70-90° • Mutation von ArgR senkt Zwang zum cis-Produkt

9. Zustand im Plasmid-Monomer: ArgR, XerCD und PepA bilden Komplex an cer-site ArgR kann als „Dimer von Trimeren“ angesehen werden Ein Trimer kann die cer-site binden

10. Zustand im Plasmid-Dimer • 2 single-site Komplexe assoziieren • Synaptischer Komplex • ArgR bildet Brücke

11. Zustand im Plasmid-Dimer • Arg alleine ist zu schwach um den Komplex zu stabilisieren • Stabilisierung durch Anlagerung von Supercoil-DNA • Stabilisierung kann nur in cis funktionieren • Topologisch einzigartiges Rekombinationsprodukt

12. Verbindung zwischen Rekombination und Zellteilung • Promotor Pcer an der cer-site • Genprodukt (Rcd) inhibiert Wachstum der Zellen • Stopp des Zell-Zyklus • c(Rcd) ist in Zellen mit Multimeren erhöht • Synaptische Komplexe verändern DNA-Struktur und ermöglichen Transkription von Pcer Rcd bildet eine Checkpoint bei der Replikation

13. Der Rcd-Checkpoint • Bei Zellteilung mit unvollständiger Multimerauflösung besteht die Gefahr plasmidloser Tochterzellen • Problem: langsamer Rekombinationsmechanismus • Erster Strangaustausch wird von XerC katalysiert • Bildung der Holiday-junction • Kein XerD-katalysierter Austausch den Gegenstrangs • Komplex muss disoziieren, Auflösung der Holiday-junction erfolgt durch zelleigene Resolvase • Verlangsamung des Gesamtvorgangs • Erhöhung der Chance von Multimeren

14. Zusammenfassung • Plasmid-Multimere stellen die Zelle vor Probleme • Xer-cer Rekombination löst Multimere auf • Langsamer Vorgang • Rcd-Checkpoint sichert Replikation ab