Ilgdzīvotības molekulāri ģenētisko pamatu padziļināta izpēte Latvijas populācijā

1. Ilgdzīvotības molekulāri ģenētisko pamatu padziļināta izpēte Latvijas populācijā 2008. gads

2. Pētījums veikts Latvijas Universitātes Bioloģijas fakultātē sadarbībā ar Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centru LU pētniecības projekta nr.: 2008/ZP-5 Projekta izpildītāji: V. Baumanis, L. Pliss, I. Pelnēna, A. Grunskis, A. Brakmanis, K. Brangulis, B. Steinbrekera, A.Krūmiņa

3. Pētījuma aktualitāte Mitohondriālās DNS (mtDNS) pētījumi: • Organismiem novecojot, pakāpeniski palielinās mtDNS mutāciju skaits, radot heteroplazmiju – atšķirīgus mtDNS variantus vienā indivīdā. • Turklāt, noteikti nosacīti neitrālie iedzimtie mtDNS polimorfismi ar atšķirīgu biežumu ir sastopami dažādās vecuma grupās. • Iespējams, ka mtDNS variantu ietekme uz bioloģiskās novecošanās procesiem ir populāciju specifiska, un, ka šo ietekmi iespaido kā pētāmās populācijas genofonda īpatnības, tā arī vides apstākļi.

4. Pētījuma aktualitāte • HLA - DRB1 pētījumi palīdzētu: • konstatēt ilgdzīvotāju imunoloģiskās ģenētiskās īpatnības, nosākot HLA (human leukocyte antigens) II klases DRB1 gēna otrā eksona variabilitāti. • izprast CD4+ limfocītu nozīmi HIV replikācijas nomākšanā; • farmakoģenētikā (palīdzēt izstrādāt pareizu farmaceitisko preparātu lietošanu atkarībā no atrastajiem DRB1 gēna polimorfismiem).

5. Mitohondriālās DNS (mtDNS) pētījumi

6. Mitohondriju bojājums mtDNS punktveida mutācijas Mutantās mtDNS amplifikācija mtPTP aktivācija Šūnas nāve Šūnu daudzums funkcionālais slieksnis Bērnība Jaunība Pusmūžs Vecums “Mitohondriālais novecošanās pulkstenis”

7. Mitohondriālā DNS (mtDNS) • Katrā šūnā ir apmēram • 1 000 – 10 000 mitohondriju, bet mitohondrijā 1-15 mtDNS kopijas • Cirkulāra, divpavedienu DNS • Garums – 16 569 bp • Nav pierādīta rekombinācija • Ir nedaudz atšķirīgs ģenētiskais kods nekā kodola DNS • Ir 37 gēni, kas kodē 13 proteīnus, 22 tRNS un 2 rRNS • Nav intronu

8. mtDNS genotipi • Haplotips – konkrēts mtDNS sekvences tips, kas var būt unikāls vai arī atrasts vairākos indivīdos • Haplogrupa – līdzīgu haplotipu kopums, kuriem ir viena vai vairākas kopīgas alēles

9. mtDNS mutācijas

10. Mērķis un uzdevumi Mērķis: Izpētīt mtDNS genotipu daudzveidību trīs dažādās vecuma grupās Uzdevumi: 1. Iegūt ģenētisko informāciju par Latvijas ilgdzīvotājiem 2. Noskaidrot mtDNS polimorfismu un heteroplazmijas iespējamo saistību ar novecošanos Latvijas populācijā

11. Materiāls • mtDNS polimorfismu analīzei izmantoti latviešu DNS paraugi: • 351 indivīds vecumā no 18 līdz 40 gadiem • 100indivīdi vecumā no 74 līdz 89 gadiem • 100 indivīdi vecumā virs 90 gadiem • Heteroplazmijas analīzē iekļauti 140 paraugi: • 40 indivīdi vecumā no 18 - 40 gadiem • 50 indivīdi vecumā no 74 - 89 gadiem • 50 indivīdi vecumā virs 90 gadiem

12. Metodes • mtDNS haplotipu un haplogrupu noteikšana: • HVSI (620bp) un HVSII (450bp) segmentu tiešā nukleotīdu sekvenēšana • mtDNS kodējošā rajona PCR-RFLP analīze • Datu statistiskā apstrāde ar Fisher`s testu un ARLEQUIN 4.0 programmu (Excoffier, 2005) • Heteroplazmijas noteikšana: • “mismatch” specifiskā DNS endonukleāze (“Surveyor”) • Denaturējošā gradienta gēla elektroforēze (DGGE) • Hetero- un homo-dupleksu tiešā nukleotīdu sekvenēšana • Datu statistiskā apstrāde ar Fisher`s testu ARLEQUIN 4.0 programmu (Excoffier, 2005)

13. KONTROLES RAJONS MetodesmtDNS haplotipu noteikšana Kontroles rajona analīze (HVSI un HVSII)

14. M 1 2 3 4 5 10% PAAG MetodesmtDNS haplogrupu noteikšana Kodējošā rajona PCR-RFLP analīze Lai apstiprinātu iegūto mtDNS haplotipu piederību noteiktam mtDNS haplogrupām, tika izmantotas 17 dažādas restrikcijas endonukleāzes: 73Alw44I, 3007Bsh1236I, 4332Eco47I, 4577NlaIII, 4643RsaI, 4769AluI, 4793BsuRI, 4831HhaI, 5003DdeI, 7025AluI, 8249AvaII, 8446SspI, 8994HaeIII, 10032AluI, 10397AluI, 12308HinfI, 13704BstOI, 14465AccI, 14766MseI, 15606AluI, 15904MseI, un 16487DdeI

15. MetodesHeteroplazmijas noteikšana • Heteroplazmija ir divu vai vairāku ģenētiski atšķirīgu mtDNS sekvenču klātbūtne vienā indivīdā • Heteroplazmija var būt pārmantota vai radusies somatisku mutāciju rezultātā

16. 5 7 8 9 6 M 1 2 3 4 6% PAAG MetodesHeteroplazmijas noteikšana DGGE “Surveyor”

17. RezultātimtDNSvariantu ģenētiskā daudzveidība mtDNS saliktais haplotips – haplogrupu un HVSI vai haplogrupu, HVSI un HVSII ģenētiskā kombinācija A. Haplogrupasun HVSI B. Haplogrupas, HVSI un HVSII

18. RezultātiDažādu vecuma grupu salīdzinājums A. Haplogrupas B. Haplogrupas un HVSI C. Haplogrupas, HVSI un HVSII

19. RezultātimtDNS heteroplazmija HVSI segmentā

20. Secinājumi • Mūsu rezultāti apstiprina hipotēzi, ka noteikti mtDNS lokusu polimorfismi ir saistīti ar novecošanos un ilgdzīvošanas fenomenu Latvijas populācijā • Heteroplazmijas līmenis pakāpeniski palielinās līdz ar vecumu, kā arī vecākiem indivīdiem ir novērotas vairākas heteroplazmiskās pozīcijas • Novērotas atšķirības starp dažādu vecuma grupu paraugiem Latvijas populācijā norāda, ka eksistējošā ģenētiskā asociācija starp mtDNS polimorfismiem un novecošanos vai ilgdzīvotību ir populāciju specifiska, un tā ir atkarīga gan no populācijas genofonda, gan no apkārtējās vides faktoriem

21. Pliss L., Pelnena I., Puzuka A., Baumanis V., Krumina A. Genetic analysis of 12 Y-chromosomal STRs haplotypes in the Latvian population (2008). FEBS Journal, Suppl.1, p. 358. • Brakmanis A., Krumina A., Pliss L., Baumanis V. Link between ageing and mitochondrial DNA variation in the Latvian population (2008). FEBS Journal, Suppl.1, p. 455. • Krumina A., Pliss L., Brakmanis A., Novicka A., Baumanis V. Evaluation of different approaches for the comparative analysis of mitochondrial genome variation in human populations (2008). XX International Congress of Genetics, Abstract book, p.322. • Pliss L., Pelnena I., Puzuka A., Sabule A., Rozane S., Ivanovs A., Baumanis V., Krumina A. Y chromosomal short tandem repeats (Y-STRs) and it’s association with azoospermia factors’ (AZF) microdeletions of infertile males (2008). American Journal of Human Genetics, Suppl.1, p.677. Publikācijas un konferenču ziņojumi