Ciências Farmacêuticas 2º ano Métodos Instrumentais de Análise I

1. Ciências Farmacêuticas 2º anoMétodos Instrumentais de Análise I Validação de métodos para a determinação de fluoxetina em cápsula

2. O que é a validação de um método analítico? • Validar um método significa estabelecer o nível de desvios (qual a ordem de grandeza dos erros) que se pode gerar nos resultados e conhecer os parâmetros que podem modificar os resultados obtidos; • Significa dar garantias de que os resultados gerados pelo método que cumprem o propósito para o qual se destinam e são aceitáveis dentro de certos limites quando mantidas certas condições conhecidas.

3. O que é a validação de um método analítico? • Assim, a validação de um método analítico está relacionada: • Com a identificação de fontes potenciais de erros • Com a quantificação dos erros potenciais no método. Uma validação do método descreve portanto, em termos matemáticos e quantitativos, as características do desempenho do método.

4. Objectivo • O objectivo deste trabalho édesenvolver e validar um método espectrofotométrico e um outro cromatográfico para análise de rotina e controlo da qualidade de cápsulas de cloridrato de fluoxetina, que possam ser empregues tanto na indústria farmacêutica como em farmácias.

5. Métodos referenciados no artigo para a validação do método • Espectofotometria Uv- Vis de duplo feixe; • Cromatografia (Adaptado ao método oficial); • Comparação com o método oficial da farmacopeia brasileira- cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para determinação de fluoxetina em medicamentos

6. Espectofotometria Uv-Vis de duplo feixe • Tem um detector de 190 a 1100 nm e células de quartzo de 1 cm. Para o método espectrofotométrico proposto foi utilizado etanol puro como solvente; • O aparelho foi calibrado com os respectivos solventes e a leitura das absorvâncias foi realizada a 276 nm.

7. Cromatografia • Para o método oficial da Farmacopeia Brasileira (cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ), utilizou-se a solução de HCl 0,1 M. O aparelho foi calibrado a 227 nm. • O método cromatográfico foi utilizado com comprimento de onda variável, detector de arranjo de diodos (baseado na detecção da radiação do Uv-Vis) e injector automático. • Para a separação cromatográfica foi utilizada uma coluna analítica mantida a 30 ºC durante a análise. • A fase móvel foi a solução tampão de trietilamina com pH 6,00 ± 0,05 ajustado com ácido fosfórico, tetra-hidrofurano sem estabilizante e metanol, sendo a detecção a 227nm. • Todas as eluiçõesforam feitas em condições isocráticas (igual composição da fase móvel).

8. Validação dos métodos • Os métodos propostos foram avaliados, validados ecomparados estatisticamente com o método espectrofotométrico da Farmacopeia Brasileira

9. Especificidade • Espectofotometria Uv-Vis de duplo feixe: preparou-se solução padrão de cloridrato de fluoxetina 200 μg/mL em etanol puro e soluções placebo de cada excipiente preparadas na concentração correspondente a 100% da quantidade declarada de analito na formulação. Traçou-se o espectro de cada solução na faixa de 220 a 350 nm e observou-se a presença de sinais na faixa de leitura do analito; • Método Cromatográfico: foi preparada uma solução padrão de cloridrato de fluoxetina 60,00 μg/mL em fase móvel e soluções placebo de cada excipiente na concentração correspondente a 100% da quantidade declarada de analito na formulação. As soluções padrão e placebos foram injectadas no cromatógrafoe avaliada a presença de picos na região do tempo de retenção do analito.

10. Linearidade • Foram preparadas soluções em triplicata em várias concentrações (μg/mL )de cloridrato de fluoxetina (substância química de referência) em etanol puro a várias concentrações (μg/mL) em HCl 0,1 M; • foram preparadas soluções em triplicatas em várias concentrações (μg/mL) em fase móvel para os métodos referenciados. A equação da recta foi obtida pelo método dos mínimos quadrados e calculou-se o coeficiente de correlação de Pearson.

11. Precisão • A precisão foi determinada partindo-se de 6 tomadas de ensaio de 12,50 mg de cloridrato de fluoxetinaobtendo-se soluções na concentração de 250,00 μg/mL para o método EspectofotométricoUv-Vis de duplo feixe, 15,00 μg/mLpara o método Cromatográficoe 50,00 μg/mL para a cromatografia líquida em placa de alta eficiência; • As soluções foram determinadas em triplicata. A precisão foi avaliada no mesmo laboratório, utilizando o mesmo equipamento em dias diferentes e com analistas diferentes. A partir dos resultados obtidos foram calculados o desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV).

12. Exactidão • A exactidão, expressa em percentagem, foi avaliada a partir da adição e recuperação de quantidades conhecidas de cloridrato de fluoxetina padrão em amostras comerciais; • Para o método EspectofotométricoUv-Vis de duplo feixe foram preparadas soluções em triplicata contendo mistura de solução amostra de cloridrato de fluoxetina; • Para o método Cromatográfico, mistura de solução amostra de 5,00 μg/mL e solução padrão de 5,00; 10,00 e 15,00 μg/mL • para o método da cromatografia líquida em placa de alta eficiência , mistura de solução amostra de 30,00 μg/mL e soluções padrões de 30,00; 40,00 e 50,00 μg/mL. • As quantidades recuperadas de cloridrato de fluoxetina padrão adicionadas foram obtidas a partir da curva de calibração. A recuperação de 98,00 a 102,00% é recomendada para exactidão do método.

13. Robustez • O estudo foi efectuado utilizando 3 fabricantes de etanol puropara o método EspectofotométricoUv-Vis de duplo feixe; • variação do pH da fase móvel para o método de cromatografia líquida em placa de alta eficiência; • As análises foram realizadas em triplicata. As concentrações de cloridrato de fluoxetina, expressas em μg/mL, foram obtidas a partir da curva de calibração.

14. Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) • O LD e o LQ da fluoxetina para os métodos propostos foram determinados a partir das respectivas curvas de calibração padrão e foram calculados o desvio padrão, curva de calibração e inclinação da curva padrão.

15. Análise estatística para comparação dos métodos • Os resultados obtidos pela aplicação dos três métodos foram comparados estatisticamente empregando a análise de variância (ANOVA factor único) ao nível de 95% de confiança; • Para avaliação estatística da robustez empregou-se ANOVA factor único e o teste de Tukey.

16. Aplicação do método em cápsulas comerciais e manipuladas • O teor de fluoxetina no produto comercial e cápsulas manipuladas foi determinado utilizando o método espectrofotométrico proposto; • Foram pesadas 10 unidades e partindo de um peso médio dilui-se em etanol absoluto obtendo-se solução contendo 268,32 μg/mL de fluoxetina; • As análises foram realizadas em triplicata e as absorvâncias foram determinadas em espectrofotómetroa 276 nm contra etanol puro como branco; • As concentrações expressas em μg/mL foram obtidas a partir da curva de calibração.

18. Conclusão • Os métodos analíticos propostos para determinação de cloridrato de fluoxetina em cápsulas por CLAE e por UV são específicos, exactos, robustos e lineares na faixa de 40,00 a 80,00 μg/mL e 100,00 a 300,00 μg/mL, respectivamente; • A aplicação do ANOVA factor único indica que os métodos propostos são equivalentes estatisticamente ao método oficial; • O método espectrofotométrico quando comparado ao método cromatográfico é uma alternativa económica e de fácil execução, podendo ser utilizado em análise de rotina e de controlo da qualidade de cápsulas de fluoxetina.