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聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction

聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction. 上海第二医科大学 检验系 樊绮诗. PCR 技术. 由美国 Cetus 公司 K.Mullis 于 1983 年建立 能在体外复制已知序列的 DNA 片段 具有扩增效率高和特异性强的特点 为生命科学领域的研究开创了崭新时代. 5’. 3’. 5’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’.

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聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction

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  1. 聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction 上海第二医科大学 检验系 樊绮诗

  2. PCR技术 • 由美国Cetus公司K.Mullis 于1983年建立 • 能在体外复制已知序列的DNA片段 • 具有扩增效率高和特异性强的特点 • 为生命科学领域的研究开创了崭新时代

  3. 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR原理 d.NTPs 引物 添加反应混合液 及样本 耐热DNA聚合酶 加入试管中 变性 退火

  4. 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ 5’ Taq Taq 5’ PCR原理 延伸 继续延伸 循环

  5. 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ PCR原理 第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 第n个循环 2n个拷贝

  6. PCR的反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。

  7. PCR的反应条件 • 反应温度（变性、退火、延伸） • 反应时间（变性、退火、延伸） • 循环次数（PCR效率及产物量）

  8. 变性温度和时间 模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前 提。在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给 予足够的时间和温度，使基因组DNA充分变 性。一般在940C变性5～10 min。进入循环反 应后以94℃变性30～40s, 足以使模板DNA双 链变性。

  9. 退火温度和时间 PCR反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm50C左右，退火温度越高，产物的特异 性也越高；被扩增片段越大，退火所需时 间也相应延长。

  10. 延伸温度与时间 延伸温度设为72℃，因为Taq DNA聚合 酶在72℃时具较高的酶促活性，有利于DNA 的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过 长易导致非特异性扩增。

  11. 模 板 (template) • 模板就是将要被复制的核酸片段（包括基 因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA 等） • 模板DNA须有较高的纯度 • 模板加入量影响PCR效率和产物的特异性

  12. 引 物（Primers) • 化学合成的寡核苷酸 • 能与模板特异地结合 • 引物决定产物的特异性和长度 • 引物设计时必须遵循一些原则

  13. 引物设计基本原则 • PCR反应的引物需要二条，分别设在被 扩增目的片段的二端，并分别与模板正 负链序列互补 • 引物的长度一般以18~25个核苷酸为宜 • 二条引物之间（尤其在3’端）的序列不 可有互补，以免形成引物二聚体 • 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、 嘧啶碱基堆积

  14. 引物设计基本原则 • 引物的3’端尤其要避免重复的CG碱基序列 • 二条引物的Tm值不能差别太大 ℃Tm=2（A+T）+4（C+G） • 合成引物时在其5’端可以加修饰成份 • 设计引物最好用电脑软件进行分析

  15. 脱氧核苷三磷酸（dNTP） • 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 • 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 • 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加

  16. DNA聚合酶 • 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖 噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐热稳定性 • Taq 酶的作用: 催化DNA合成。即在模板指导下，以dNTP 为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷 酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿 5’→3’方向延伸

  17. 镁离子浓度 • 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性十分重要 • 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。

  18. PCR反应体系(25ml) 试剂浓度 体积(ml) 终浓度 去离子水 15.8 正向引物 10 mmol/L 1.0 0.4mmol/L 反向引物 10 mmol/L 1.0 0.4mmol/L 10×PCR反应缓冲液 10× 2.5 1× 镁离子 25 mmol/L 2.5 2.5mmol/L dNTP 25 mmol/L 0.2 200mmol/L Taq DNA聚合酶 1U/ml 1.0 0.04U/ml 模板DNA 100ng/ml 1.0 4.0ng/ml 配制PCR反应体系（例）

  19. 其它反应因素 • pH应保持在酶反应所需的最适pH • 盐浓度（引物与模板杂交率、杂交体稳定性 及聚合酶的活性） • 二甲亚砜（DMSO）能破坏模板的二级结构 • 牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶 的活性

  20. 循环次数 • 重复次数一般设为25～35个循环 • 35个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消耗和反应副产物的产生，此时扩增产物量不再随 循环次数的增加而呈指数增长，即反应已处于平 台期

  21. 理论值 实际值 Log 产物DNA PCR过程的实时监测 • 指数增长期 • 线形增长期 • 平台期 循环数 #

  22. 理论值 实际值 Log 产物DNA 相对定量PCR 设计相对定量PCR实验方案时须注意： • 预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效应。 • “管家基因”与靶基因同管扩增，扩增产物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者 分离开。

  23. 绝对定量 PCR • 外参照系统的设置 • 内参照系统的设置 • 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析

  24. Q 5’ 3’ R 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ Taq Probe 5’ 3’ Q R 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ TaqManTM d.NTPs Primers Add Master Mix and Sample Thermal Stable DNA Polymerase Reaction Tube Denaturation l Annealing

  25. Q R 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ R R Q 3’ Taq Taq Taq Taq Q R R R 5’ 3’ 3’ 5’ Q Q 3’ 5’ TaqManTM Extension Step 1. Strand Displacement 2. Cleavage 3. Polymerization Complete l 4. Detection

  26. PCR产物的检测 • 凝胶电泳分析： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 酶切分析 • 分子杂交 Southern印迹杂交、斑点杂交 • 核酸序列分析

  27. DNA突变的PCR检测技术 • PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） • 等位基因特异性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO） • 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP） • 变性梯度凝胶电泳（DGGE） • 融点曲线分析（melting curve analysis） • PCR产物的序列分析

  28. PCR-SSCP 单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于 该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经 变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的 单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正 常与突变的DNA 不同顺序 不同构象 不同电泳行为

  29. SSCP技术检测DNA突变

  30. s Southern印迹杂交

  31. 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) DGGE是一种筛选单碱基突变及多态性的方法。DGGE检测突变的原理是基于给定DNA双链的解链温度因存在突变而发生改变加以测定。DGGE的突变检出率可达90%～100%。

  32. DGGE检测DNA突变

  33. PCR产物的序列分析 主要见于分子克隆时对于目的基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。 可将产物纯化后作为模板直接测序， 也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好 ，常用T-A克隆。

  34. PCR反应的特点 • 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 • 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 • 简便、快速 2～4 小时完成扩增 • 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板

  35. PCR技术的质量控制 实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施

  36. 以PCR为基础的相关技术 • 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) • 定量PCR (quantitative PCR ) • 多重PCR (multiplex PCR) • 免疫PCR • 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) • PCR诱导定点突变 • 原位PCR (in situ PCR)

  37. 图例 差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)

  38. PCR技术在分子诊断中的应用 • 感染性疾病中病原微生物核酸的检测 • 单基因遗传性疾病的基因诊断 • 多基因病相关基因的检测 • 肿瘤相关基因的检测 • 移植配型和法医学上的应用

  39. 遗传性疾病的基因诊断 （例：血红蛋白病中的地中海贫血） 1 2 3 4 1.正常内对照 2.Bart’s水肿标本 3.反应体系故障扩增失败 4.分子量标准 PCR用于α-地贫Bart’s水肿产前诊断

  40. 血友病的分子诊断 • X染色体连锁隐性遗传 • FⅧ基因和FⅨ基因发生突变 血浆凝 血因子Ⅷ和Ⅸ的合成量和（或）质的异常 患者反复自发性出血 • SSCP、DGGE等检测技术

  41. DMD的分子诊断 • X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病率 为1/3 500个男孩 • DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷 • 检测DMD基因的技术： Southern印迹、多重PCR

  42. PCR在移植配型上的应用 二十世纪80年代后期，分子生物学技术被引入 HLA领域，人们在PCR基础上发展了各种DNA分型 技术检测I类和II类抗原位点的等位基因 • PCR-RFLP • 序列特异性寡核苷酸探针技术 （PCR-sequence specific oligonucleotide probe, SSOP） • 序列特异性引物扩增技术 （PCR-sequence specific primer, SSP）

  43. PCR技术在法医学上的应用 • 个人认识 • 亲子鉴定 • 性别鉴定

  44. PCR技术在分子生物学中的其它应用 • DNA克隆 • 引入点突变、缺失或插入 • 重组PCR • DNA序列的测定 • 基因定量

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