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第三章 地衣共生菌藻的分离、 培养和人工重建

第三章 地衣共生菌藻的分离、 培养和人工重建. 地衣是否能分为单个生物 不同有机组织的相互关系 更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题 次生代谢物的研究. 一、共生真菌的分离和培养. 1、地衣型真菌常用的培养基 2、子囊孢子释放法 3、组织培养法 4 、培养共生菌的保存. 1 、地衣型真菌常用的培养基. WA4 培养基 —— 含 4% 蒸馏水的琼脂培养基 琼脂 4g 蒸馏水补足 100ml MY 培养基 —— 麦芽酵母提取物培养基

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第三章 地衣共生菌藻的分离、 培养和人工重建

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Presentation Transcript

  1. 第三章 地衣共生菌藻的分离、培养和人工重建

  2. 地衣是否能分为单个生物 • 不同有机组织的相互关系 • 更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题 • 次生代谢物的研究

  3. 一、共生真菌的分离和培养 1、地衣型真菌常用的培养基 2、子囊孢子释放法 3、组织培养法 4、培养共生菌的保存

  4. 1、地衣型真菌常用的培养基 • WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基 琼脂 4g 蒸馏水补足100ml • MY培养基——麦芽酵母提取物培养基 麦芽提取物 20g / 酵母提取物 2g / 琼脂20g / 蒸馏水补足1000ml • LB培养基——Lilly and Barnett’ s培养基 葡萄糖10g / 天冬酰胺酸2g / KH2PO4 1g / MgSO4•7H2O 0.5g / Fe(NO3)3•9H2O 0.2 mg / ZnSO4•7H2O 0.2mg / MnSO4•4H2O 0.1mg / 维生素B1 0.1mg / 维生素H 5ug / 蒸馏水补足100ml 可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足 1000ml，并制成固体培养基。 • LBG 培养基——Lilly and barnett gelrite 培养基 LB培养基中以1%的Gelrite 代替琼脂。 注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前应将所有培养基进行灭菌。

  5. 2、子囊孢子释放法

  6. 3、组织培养法

  7. 4、培养共生菌的保存 • 共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）。 • 通常共生菌在15~20℃时表现出最大生长率。每种均有其最适生长PH值，通常PH范围为5~6。太高或太低的PH均会阻碍其生长。 • 在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。 • 地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。

  8. 二、共生藻及蓝细菌的分离和培养 1、培养基 2、培养前处理 3、共生藻的培养 4、无菌培养群体的分离 5、共生藻培养的保存

  9. 1、培养基 • BBM培养基——Bold’s Basal Medium • 3×N BBM培养基 • Trebouxia培养基 • MDM培养基

  10. 2、培养前处理 1）清洗 • 对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约1㎝2，然后放在自来水中浸泡5~10分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。 • 对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入装有1~2 ml的无菌水和一滴Tween－20的小试管中。超声波粉碎约3分钟。离心去除地衣体表面的附属物。

  11. 2）地衣体匀浆液的制备 • 大型地衣（枝状或叶状）： （1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。 （2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。 （3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。 （4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。

  12. 较小地衣体： 清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。

  13. 3、共生藻的培养 • 含共生藻的悬浊液 • 15天培养：15～20℃ • 共生藻群（1个月左右） • 要注意藻的污染

  14. 4、无菌培养群体的分离 直接挑选法：体视显微镜 喷雾法 微量吸管吸法 离心法

  15. 利用喷射法对共生藻进行分离的方法

  16. 利用微量锡罐分离单个细胞的共生藻

  17. 5、共生藻培养的保存 • 在低光照的条件下，可以培养很长一段时间 （约1年） 。最好每2~3个月传代一次。大多数的地衣共生藻的最佳生长温度为15~20℃。其生长的最佳pH范围是4~7。 • （1）用解剖刀将带有琼脂培养基的共生藻群体分为几部分（约５mm2），将群体放在有合适培养基的皮氏培养皿中培养2-3个月. • （2）每2-3个月将生长的群体转移到相同成分的新鲜培养基上，在相同的条件下培养。地衣共生藻也可以在液氮下冷冻保藏相当长的时间仍保持活性。

  18. 三、地衣菌、藻共生的人工重建 Stocker-Wörgötter（1994） 地衣体人工重建的基本操作步骤如下： （1）收集你想重建的地衣（如Peltigeraaphthosa）基物处的土壤。 （2）用筛孔约1~2mm的筛子将500g土壤过筛，然后在其中加入100ml的二次蒸馏水。 （3）将湿的土壤放入100×15mm的玻璃皮氏皿中，填充高度为8mm。对其进行高压灭菌后放置24小时，然后再次高压灭菌。

  19. （4）用无菌培养的共生绿藻和蓝细菌对土壤进行接种，然后在以上所描述的培养条件下对其进行培养。（4）用无菌培养的共生绿藻和蓝细菌对土壤进行接种，然后在以上所描述的培养条件下对其进行培养。 （5）准备好用于人工重建的分离的共生真菌，并将其转移到无糖的液体培养基上（如BBM），然后培养约1个月。 （6）将匀浆所得的菌丝体覆盖到绿藻或蓝细菌群体上。 （7）将重建群体在培养室中培养，培养室条件应同他们共生藻的生长条件一致。

  20. 思考题： 1．地衣共生菌分离方法有哪些？并简述孢子释放法步骤。 2．共生藻的分离培养方法哟哪些？ 3．简要说明地衣人工重建的研究进展。

  21. THANKS

  22. 思考题： 1．衣共生菌的分离方法有哪些？并简述孢子释放法步骤。 2．共生藻的分离培养方法有哪些？ 3．简要说明地衣人工重建的研究进展。

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