第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化

1. 第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化

2. 一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 在蛋白质分子中，游离的α—NH2和α—COOH相距较 远，静电引力减弱，故： a 末端的α—NH2的pK′值减少 b 末端的α—COOH的pK′值增大

3. 1、蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。

4. 对于溶液中蛋白质颗粒， pH=pI 时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场 中不移动 pH＞pI 时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场 中向阳极移动 pH＜pI 时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场 中向阴极移动 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。

5. 2、蛋白质的等离子点（特征常数） • 蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化， 原因是蛋白质分子中某些解离基团与中性盐中的离子相结合。蛋白质的等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。 • 等离子点（isoionic point）：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点 (蛋白质的等离子点：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。)

6. （二）、蛋白质的胶体性质 1.蛋白质溶液稳定的因素： 蛋白质分子大小属于胶体质点范围 （1）水化层：分子表面上亲水 基团在水溶液中能与水分子 起水化作用 • （2）双电层：分子表面上的 可解离基团，在适当的pH条件下 ，都带有相同的电荷，与其周围 的反离子构成稳定的双电层。

7. 2、蛋白质的沉淀 • （1）概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中 析出的现象。 • （2）原理：破坏稳定因素：水化膜和双电层 （3）沉淀方法： ①盐析法 ②有机溶剂沉淀 ③重金属盐沉淀　条件: pH＞pI (Pr- M+) ④某些酸类沉淀　条件：pH＜pI (Pr+ X-) ⑤抗体对抗原蛋白质的沉淀

8. ①盐析法 蛋白质不变性 定义：加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出的现象。 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶解度大 （另外：NaCl、 NaSO4等）。 原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质 分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种 蛋白质分段析出。 • 温度 • pH值 • 蛋白质浓度 影响盐析的因素有：

9. 实例分析：血清中加硫酸铵至50%饱和度，则球蛋白先析出；继续加入硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。微生物发酵生产酶制剂就是采用盐析的作用原理，从发酵中把目的酶分离提取。

10. ②有机溶剂沉淀 低温蛋白质不变性 • 有机溶剂：乙醇、丙酮等。 • 原理：破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。 • pH=pI时，可加速蛋白质沉淀。 • 低温（0℃∽4 ℃）。

11. 有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，操作时需注意：有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，操作时需注意： （1）低温操作：提取液和有机溶剂都需事先冷却。向提取液中加入有机溶剂时，要边加边搅拌，防止局部过热，引起变性。 （2）有机溶剂与蛋白质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好，要及时分离沉淀，除去有机溶剂。 实例分析：食品级的酶制剂的生产，中草药注射液、胰岛素的制备大都用有机溶剂分离沉淀蛋白质。有机溶剂的添加量最好不超过沉淀目的酶所必要的数量，多加有机溶剂会使更多的色素、糊精及其它杂质沉淀。

12. ③重金属盐沉淀　 蛋白质变性 氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。

13. NH3+ Pr COO- NH3+ Pr COOH NH3+X- Pr COOH H+ X- ④生物碱试剂和某些酸类沉淀 蛋白质变性 苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。 反应条件: pH<pI X- ：酸根 不溶性蛋白盐 机理 ：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。

14. 实例分析：在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混浊。 柿石症？ “ 柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”

15. ⑤ 等电点沉淀：蛋白质不变性，原理？

16. ⑥ 加热变性沉淀 实例分析：我国很早便创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2）的制豆腐方法，这是成功地应用加热变性沉淀蛋白的一个例子。 3、蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，称为蛋白质的凝固作用。 因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。

17. 沉淀类型 A.可逆沉淀 在发生沉淀反应时，分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。 B.不可逆沉淀/变性沉淀 在发生沉淀反应时，内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂或水溶液中的作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

18. （三）蛋白质的紫外吸收 • 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 • 这三种氨基酸的在280nm附近有最大光吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。 • 蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定利用这个性质，可以对蛋白质进行定性定量鉴定。

20. 二、蛋白质的变性与复性 1.蛋白质变性的概念 蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。 2.变性的本质 次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏

21. 3、变性理论 • 1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。 4.变性的因素 ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波 ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。 （如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）

22. 常用的变性剂：尿素和十二烷基硫酸钠（SDS） 尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水中的溶解度，从而降低疏水相互作用。 SDS: 破坏蛋白质分子内的疏水相互作用，使非极性基团暴露于介质中。并可以负离子形式与松散的肽链结合。

26. 5、变性蛋白质的特性 • 生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变性失去催化作用。 • 物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，失去结晶能力，旋光值改变。 • 化学性质改变，如：蛋白质变性时，有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧链活性基团，由于结构的伸展松散而暴露，易与化学试剂反应。 • 生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易为蛋白质水解酶所分解。 ★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。

27. 6、应用举例 • 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 • 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 7、蛋白质变性、沉淀与凝固的关系 * 变性的蛋白质不一定沉淀，也不一定凝固； * 沉淀的蛋白质不一定变性，也不一定凝固； * 凝固的蛋白质肯定变性，且不可逆。凝固 的蛋白质不一定沉淀，但非常容易沉淀。

28. 蛋白质沉淀、变性和凝固的关系，下面叙述正确的是蛋白质沉淀、变性和凝固的关系，下面叙述正确的是 A、变性蛋白一定要凝固 B、蛋白质疑固后一定变性 C、蛋白质沉淀后必然变性 D、变性蛋白一定沉淀 E、变性蛋白不一定失去活性

29. 8、蛋白质的复性 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) ，这种变性也称为可逆变性。 • 有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。

31. 现代生物实验技术 层析技术 沉淀技术 离心技术 过滤技术 电泳技术

32. 三、蛋白质的分子大小和形状 蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达40000000（烟草花叶病毒）。 测分子量的方法： ★化学组成测定最低分子量 ★SDS-PAGE法 ★凝胶过滤法 ★渗透压法 ★扩散系数法 ★沉降系数法和沉降平衡法

33. 1、根据化学成分测定最小相对分子质量 利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低Mr。 如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe 0.34％，则 最低 Mr=55.84×100/0.34=16700； 用其它方法测定，其实际Mr为16700的4倍，由此可知，血红蛋白含有4个Fe的原子，而不是1个Fe。 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低M=35200，实际为69000，含2个Trp

34. 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100 131)/1.65=7939.4 按照Ile的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100 131)/2.48=5282.3 由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算： X1/ X2=7939.4/5282.3≈1.5 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4  2 =15878.8 或 5282.3×3=15846.9

39. 沉降速度法 4.沉降分析法 沉降平衡法 （A）沉降速度法 在60 000～80 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离纯化蛋白质。

41. v s = ———— ω2x 沉降系数：溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用s表示。 • 一个S单位，为1×10-13秒。 • 相对分子质量越大，S值越大。 • 蛋白质的沉降系数：1～200S。 • 由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量： R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ρ：溶剂的密度 M=RST/D〔1－iρ〕

42. （B）.沉降平衡法 在离心过程中，外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，二者可达到稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度，可按下式计算分子量： M=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1－Vρ)(x22－x12)]其中C2和C1是离轴心距离为x2和x1时的蛋白质浓度。 沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低（8000－20000转每分）。但要达到平衡常常需要几天时间。厘米.克.秒制时，等于8.314×107尔格/秒。

44. 5、凝胶过滤法 原理：凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex • 洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的洗脱液体积。

46. 测定样品蛋白质分子量的方法： ① 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕； ② 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图,得标准曲线； ③ 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕； ④ 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。

48. 蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率

50. 方法： ① 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性并 与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带负电（SDS带负电），且荷质比相同；不同蛋白 质分子具有相似的构象。 ② 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图 ③ 测出待测样品的迁移率 ④ 从标准曲线上查出样品的相对分子质量