5.3 维生素

1. 5.3 维生素 • 维生素（vitamin）是机体维持正常功能所必需，但在人体内不能合成或合成量很少，必须由食物供给的一组低分子量有机物质。 • 维生素的功能通常是作为酶的辅助因子（辅酶与辅基）。因此它对动物体正常生长与健康是必需的。

2. 维生素的种类繁多，化学结构差异很大，通常接溶解性质将其分为脂溶性维生素（lipid-soluble vitamins）和水溶性维生素（water-soluble vitamins）两大类。根据分布情况，水溶性维生素又可分为B族维生素与维生素C两类。

3. 5.3.1 维生素A 又名抗干眼病维生素，或视黄醇。 维生素A性质活泼，不稳定，易被氧化，遇紫外光易分解。维生素A最大吸收波长在325nm附近，具有天然荧光。

4. 维生素A在食品中常以酯类形式存在，样品用苛性碱－乙醇溶液在抗氧化剂保护下，加热皂化后，可使其转化为游离的维生素A，然后用有机溶剂提取。维生素A容易氧化，操作应在避光条件下进行。维生素A在食品中常以酯类形式存在，样品用苛性碱－乙醇溶液在抗氧化剂保护下，加热皂化后，可使其转化为游离的维生素A，然后用有机溶剂提取。维生素A容易氧化，操作应在避光条件下进行。 • 通常采用RP-HPLC分析维生素A，其优点是能以短链视黄酯作内标物，而且可能同时分离测定类胡萝卜素、视黄酯及维生素E。但使用RP-HPLC时，往往需要先除去样品的非极性溶剂，再将其溶解于流动相或适宜溶剂中。在大多数情况下，紫外325nm检测维生素A都能获得足够的灵敏度和选择性，光电二极管阵列检测器的应用也越来越普遍。

5. 牛奶、蛋黄中维生素A的HPLC测定如下： （1）样品处理 牛奶（50mL)、蛋黄(5g) 50oC 回流 30min 乙醇60mL, 50% NaOH 20mL 乙醚提取，用蒸馏水洗涤提取液 无水硫酸钠脱水后，加0.2gBHT, 定容100mL 取10mL, 在50oC恒温水浴中旋转蒸发至干, 用1.0mL无水甲醇溶解, 摇匀后上机测定.

6. (2) 色谱条件： 色谱柱为μBondapak C18 (300mm×3.9mm); 流动相为甲醇-水（90：10）； 流速1.0 mL/min; UV 325nm, 或荧光检测器，Em=480nm, Ex=325 nm; 进样2μL。

7. 5.3.2 维生素D • 维生素D又称为抗佝偻病维生素，是类固醇衍生物。主要包括 D2（麦角钙化醇）及 D3（胆钙化醇）。 • 自然界中，最丰富的维生素D的来源是鱼的肝脏和动物体的内脏。 • 从样品中提取维生素D的方法与提取维生素A的方法类似，先使用KOH或NaOH－乙醇皂化以除去类脂，再用有机溶剂提取，把水溶性的干扰成分除去，在提取时可加入抗氧化剂。

8. 测定维生素D的方法有比色法、分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法。比色法由于它的精密度及选择性差，只能用于较纯样品的测定。气相色谱法需要对样品衍生，操作麻烦。高效液相色谱法测定维生素D具有快速简便的特点，被AOAC选为正式的方法。测定维生素D的方法有比色法、分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法。比色法由于它的精密度及选择性差，只能用于较纯样品的测定。气相色谱法需要对样品衍生，操作麻烦。高效液相色谱法测定维生素D具有快速简便的特点，被AOAC选为正式的方法。

9. （1）气相色谱法 气相色谱法测定维生素D通常用甲基或三甲基硅醚化，但在测定过程中，维生素D2和维生素D3在高温（150oC)下容易形成两种热异构物，并出现两个色谱峰。由于转化成两种热异构物的比率是一定的，故可用于维生素D的测定。

10. （2）HPLC HPLC可以分离测定维生素D2和维生素D3的异构体及其代谢产物，可以将维生素D与维生素D前体及α-生育酚、维生素A及其脂类分开。一般在硅胶柱上的正相模式进行，也有用C18键合固定相，以甲醇或者乙腈做流动相。 维生素D具有强紫外吸收，一般选用紫外检测器，λmax=265 nm, λmin=228 nm.

11. 食品中同时含维生素D2和维生素D3的情况很少，植物性食品和强化食品主要含维生素D2，动物性食品主要为维生素D3。在维生素D的色谱分析中，测定维生素D3通常用维生素D2作内标，反之亦然。食品中同时含维生素D2和维生素D3的情况很少，植物性食品和强化食品主要含维生素D2，动物性食品主要为维生素D3。在维生素D的色谱分析中，测定维生素D3通常用维生素D2作内标，反之亦然。

12. 5.3.3 维生素E 维生素E又称生育酚（tocopherol），有六种，其中四种α、β、γ和δ种有生物活性。自然界以α-生育酚（结构如下图）分布最广。维生素E在无氧条件下对热稳定，但对氧十分敏感，易自身氧化，能避免脂质过氧化物的产生，因而能保护生物膜的结构和功能。 黄色粘油状物，不溶于水， 溶于有机溶剂。

13. 动物组织中所含维生素E的测定较复杂，在测定之前首先要除去类脂如胆固醇，它的存在会引起严重干扰。去除类脂通常采用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是氯仿、丙酮、乙醚和乙醇。从样品中提取维生素E有皂化法及直接提取法两种。动物组织中所含维生素E的测定较复杂，在测定之前首先要除去类脂如胆固醇，它的存在会引起严重干扰。去除类脂通常采用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是氯仿、丙酮、乙醚和乙醇。从样品中提取维生素E有皂化法及直接提取法两种。 • 直接提取法：用有机溶剂直接提取，然后在低温下进行浓缩结晶。除去脂类，将维生素E分离出来。对一些植物性样品可以用热的乙醇或丙二醇及氯仿在索氏提取器中将脂溶性物质提出来。 • 提取后净化处理：固相萃取法和TLC等。

14. （1）气相色谱法 气相色谱法测定维生素E，样品需要衍化，衍生产物通常是三甲基硅醚，用氢火焰离子检测器。采用硅酮类的OV-1、OV-17作为固定相。硅酮类的OV-1、OV-17已用于食品（如大麦、面粉、谷物、脂肪和油脂）样品的测定。 三甲基硅醚化GC法测定动物脂肪和植物油中的生育酚被推荐为IUPAC（1981）方法。

15. （2）HPLC 生育酚具有强荧光性，同时还对荧光检测器有着故有的敏感和选择性。因此维生素E测定时多选择荧光检测器（Ex295nm，Em330nm）。而生育酚酯荧光性较弱，若在色谱分析前未经水解，则要用UV检测器（280nm）。 用甲醇从食品样品中将维生素E提取出来，提取液通过反相色谱柱分离，分配体系进行HPLC分析，用含水的甲醇溶液为流动相，作恒流洗脱，在10min内即可完成一次。采用紫外吸收检测器进行测定。

16. 水溶性维生素包括B族维生素和维生素C。水溶性维生素体内过剩的部分均可由尿排出体外，因而在体内很少蓄积，也不会因此而发生中毒。又因为在体内的储存很少，所以必须经常从食物中摄取。水溶性维生素包括B族维生素和维生素C。水溶性维生素体内过剩的部分均可由尿排出体外，因而在体内很少蓄积，也不会因此而发生中毒。又因为在体内的储存很少，所以必须经常从食物中摄取。

17. 5.3.4 维生素 C 又称L-抗坏血酸（ascorbic acid）。 它在人体内不能合成，必须依靠外界供给。维生素C不仅具有广泛的生理功能，而且在食品工业上常用作抗氧化剂。因此测定食品中维生素C的含量用以评价食品品质及食品加工过程中维生素C的变化情况具有重要的意义。 测定维生素C的方法有2，4-二硝基苯肼氧化法、极谱法、荧光法、色谱法等，气相色谱法很少应用，现在多使用高效液相色谱法。

18. （1） 2，4-二硝基苯肼比色法（GB 12392-90) 用草酸提取样品，活性炭使提取液中还原型抗坏血酸氧化成为脱氢抗坏血酸，与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，其呈色的强度与总抗坏血酸含量成正比。此法操作比较简便、快速，不需要特殊仪器，并适用于各种食品。

19. （2）荧光法 抗坏血酸在氧化剂存在下，被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化型的抗坏血酸与邻苯二胺作用生成有荧光的喹喔啉衍生物。此荧光化合物的激发波长是350nm，荧光波长在433nm，其荧光强度与抗坏血酸含量成正比。

20. （3）气相色谱法 维生素C是种难挥发性的物质，通常将其衍生为三甲基硅醚衍生物，用非极性固定液作固定相，FID检测，可以分离测定抗坏血酸、脱氢抗坏血酸和2，3-dioxo-古罗糖酸。食品中维生素C可用偏磷酸进行提取，用纤维素层析柱去除干扰物质，衍生化后测定。 另一种方法是用乙醇提取食品中维生素C和非挥发性有机酸，加乙酸铅进行沉淀，再将维生素C变成游离态，衍生后测定。

21. （4）液相色谱法 HPLC测定维生素C的分离方式主要有三大类： ①反相键合相色谱，一般采用十八烷基硅烷键合相作固定相，极性溶剂作流动相； ②离子交换色谱，常采用带离子交换基团的硅胶键合相式离子交换树脂作固定相，流动相通常为酸性缓冲溶剂，有时在酸性缓冲溶剂中掺入一定量的有机溶剂； ③反相离子对色谱，它是在维生素C的HPLC分析中采用最多的方法。通常采用带烃基的非极性硅胶硅烷化键合相为固定相，以甲醇水溶液等极性溶液为流动相，在流动相中加入一种碱性反离子，常用的反离子为十二烷基三甲基铵盐等各种季铵盐。

22. 5.4 脂类和脂肪酸 • 脂类包括油类、脂肪类和类脂三种基本形式。 • 大部分构成食物的脂肪和动物体脂主要以甘油三酯为其基本结构。甘油三酯实际上就是一分子甘油与三分子脂肪酸所形成的酯，构成三个分子脂肪酸的种类很多，目前已知存在于自然界的脂肪酸有40多种。

23. 5.4.1 脂肪的提取 （1）乙醚抽提法 适用于一般食品，特别是脂肪含量比较高的，脂肪和组织结合比较少的，干燥的粉末和容易粉碎的食品。 试样粉碎或进行适当的前处理，除去水分等的脂肪容易被抽提，食品干燥状态下适宜采用索氏抽提器的抽提方法。 抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低，因为水和醇导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、可溶性糖类等，可使测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化及在烘烤时也有引起爆炸的危险。乙醚中的过氧化物，主要是在贮存过程中，由于空气、光线和温度的作用，致使乙醚缓慢氧化而形成的过氧化物。

24. 检查过氧化物的方法： 取6ml乙醚，加2ml10％碘化钾溶液，用力振摇，放置1min，若出现黄色，则证明有过氧化物存在。应另选乙醚或处理后再用。 除去乙醚中过氧化物的方法： 取乙醚5份加10％亚硫酸钠1份，加盐酸酸化，振摇、静置分层后，弃去水层，再用水洗至中性，用无水氯化钙或无水硫酸钠脱水后，再进行恒温（34.5℃）重蒸馏，重蒸馏时可放入无锈铁丝几段或光亮铝片几片，蒸馏后，再用无水氯化钙或无水硫酸钠脱水，放置一昼夜，取上层清液使用。

25. （2）酸分解法 适用于结合或包藏于组织中的脂肪。结合或包藏于组织中的脂肪常不溶于水，但加酸后因水解而形成液状的食品，如：谷类、面包、通心粉、豆类、蛋类、蘑菇类、烹调加工食品等。 （3）勒译戈特里布（Roese-Crotflieb)法 主要在牛奶和乳制品中的应用，适用于含乳脂肪的食品和含脂量比较高的液状或乳状的食品。 用乙醚抽提。 （4）氯仿-甲醇混合液抽提法 适用于大豆和大豆制品，蛋类等含磷脂等多的极性脂肪食品。 氯仿-甲醇（2：1）抽提。

26. 5.4.2 脂类气相色谱法分析 大部分脂类在GC分析前必须经过衍生化，因为它们不是挥发性差就是对热不稳定。由于脂类通常只含碳、氢、氧元素，检测一般采用氢火焰离子检测器（FID）。

27. 除了食用油外，几乎所有的脂类样品都需要初提取。对含活性酶的生物组织样提取，需要用降解酶预先将脂肪酶和脂氧合酶失活。游离脂肪可用有机溶剂直接提取，但结合了非脂类组分的脂类在萃取前需要酸水解等处理，以形成游离态。除了食用油外，几乎所有的脂类样品都需要初提取。对含活性酶的生物组织样提取，需要用降解酶预先将脂肪酶和脂氧合酶失活。游离脂肪可用有机溶剂直接提取，但结合了非脂类组分的脂类在萃取前需要酸水解等处理，以形成游离态。

28. 举例：脂肪酸酯的GC检测 • 脂肪酸酯用醚或氯仿－甲醇混合液提取后，用碱处理，甘油酯以及磷脂等构成脂肪酸的物质变成水溶性的碱盐，然后用有机溶剂去除不皂化物（甾醇、萜烯、蜡等），再用酸水解，使其转变成游离脂肪酸。经硫酸甲酯化处理后成为脂肪酸甲酯，用GC分离各种脂肪酸。 • 脂肪酸甲酯混合物大多采用填充柱进行分离，常用为3％-20％（质量分数）固定液涂渍在惰性的担体上，柱长1.5-3.0m。固定液可使用极性的或非极性的，一般极性固定液对不饱和甲酯有较好的分离，不饱和甲酯的保留时间比饱和甲酯的保留时间长，但在非极性固定液上洗脱顺序刚好相反。

29. 毛细管GC分析脂肪酸甲酯通常用极性固定相如Carbowax 20M和SP-2340。不饱和脂肪酸在极性固定相上的分离效果要比非极性相好。 • 多不饱和脂肪酸有着很高的营养价值，鱼油中所含的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）具有降血脂、抗血栓和抗动脉粥样硬化等作用。郑立立等研究了气相色谱－红外光谱联用分析鱼油中EPA和DHA的方法，采用氢火焰、红外光谱双检测器同时检测，建立了EPA和DHA的蒸气相红外标准谱图和气相色谱保留时间数据库，提供了一种在无法找到标准物质的情况下对鱼油中EPA和DHA进行定性、定量分析的简便方法。

30. 5.4.3 脂类HPLC分析 （1）脂肪 • 脂肪的HPLC分离测定可采用正相色谱法和反相色谱法。一般而言，正相色谱法主要用于脂肪类别之间的分离，而反相色谱法多用于同族物质的分离。由于反相色谱操作比较容易，因此应用较多，其中以C18柱应用最广。 • 采用RP－HPLC时非水流动相更为有利，因为它能增加脂肪的溶解度，防止在柱上出现沉淀，提高柱效和稳定性。

31. 脂肪在反相柱上的洗脱顺序与其碳链长度和双键数量有关。脂肪的不饱和度增加，出现峰较早，但链长增加，则出峰较迟。由于碳链长度和双键数量对保留时间影响正好相反，因此高碳数的饱和脂肪和多不饱和脂肪的峰形会出现重叠。通常反式异构体在对应的顺式后出峰，双键的位置越接近羧基保留时间越短。脂肪在反相柱上的洗脱顺序与其碳链长度和双键数量有关。脂肪的不饱和度增加，出现峰较早，但链长增加，则出峰较迟。由于碳链长度和双键数量对保留时间影响正好相反，因此高碳数的饱和脂肪和多不饱和脂肪的峰形会出现重叠。通常反式异构体在对应的顺式后出峰，双键的位置越接近羧基保留时间越短。

32. HPLC分析脂类最常用的检测器是蒸发光散射检测器（ELSD）。它具有以下优点：HPLC分析脂类最常用的检测器是蒸发光散射检测器（ELSD）。它具有以下优点： ①它能检测任何挥发性低于流动相的样品； ②因为ELSD的响应与样品的官能团和光学特征无关，所以脂肪酸不需要衍生，这样极大减少了样品的前处理和消除了紫外末端区检测的麻烦； ③ELSD能适用于多溶剂梯度洗脱，基线平稳，因而可提高分辨率和分析速度，测定游离脂肪酸和二甘油酯、三甘油酯； ④灵敏度很高。

33. （2）脂肪酸 常规HPLC方法用于非衍生脂肪酸的检测从灵敏度和选择性来说都是不可取的，因为其化合物通常不含有合适的发色团，许多不同的衍生技术已被用来克服这些障碍，常用的衍生化方法有以下几种。 ①苯甲酰甲基溴和苯甲酰甲基溴衍生化 这类试剂对羧酸的衍生化反应常在质子惰性溶剂如苯、乙腈、丙酮中进行。加入衍生化试剂之前先用氢氧化钾或碳酸钾或碳酸氢钾中和酸。为了提高反应的灵敏度和选择性，常常需要加入冠醚和叔胺作为催化剂。

34. ② 3-羟甲基-吡啶衍生 称取适量样品，加10倍样的3-羟甲基-吡啶和4-二甲基氨基吡啶的二氯甲烷溶液，于室温下反应3h，加己烷-乙醚（1：1）溶液提取，用2mol/L HCl和水进行液液分配，衍生物用C8柱分离，流动相为乙腈-水（92：8），UV检测或荧光检测。 ③ 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC)衍生 BrMMC是最典型的香豆素类荧光衍生化试剂，它与羧酸的反应在质子惰性溶剂（如丙酮、乙腈等）中进行，以无水碳酸钾或冠醚为催化剂。由于试剂及其衍生物对光敏感，最好在暗处操作，BrMMC可用于测定脂肪酸、二元酸等。衍生物用C8或C18柱分离，甲醇或乙腈的水溶液作流动相，荧光检测。

35. 5.5 氨基酸 • 氨基酸的分离和检测手段，以往用化学分析法、层析法、比色法、气相色谱法、氨基酸自动分析仪。 • 随着高效液相色谱及填料的发展，HPLC在氨基酸检测方面显示了其特有的优越性。但大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，为提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸衍生，衍生方式有柱前衍生法与柱后衍生法。 • HPLC与各种衍生相结合的氨基酸分析技术，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。

36. 5.5.1 样品处理 测定蛋白质中的总氨基酸，必须先把蛋白质水解成游离氨基酸。可采用酸水解、碱水解和酶水解方法，其中以酸水解法应用最广泛。 1）酸水解 • 条件：常用硫酸或盐酸进行水解。一般用6mol/LHCl，4mol/L H2SO4煮沸回流24小时左右。 • 优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为L-α-氨基酸，产物单一，无消旋现象。 • 缺点：色氨酸破坏，丝氨酸和苏氨酸有一小部分被水解，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。

37. 在蛋白质氨基酸测定中，水解过程的严格控制和条件选择至关重要，否则将引起较大的实验误差。水解时必须注意以下环节：在蛋白质氨基酸测定中，水解过程的严格控制和条件选择至关重要，否则将引起较大的实验误差。水解时必须注意以下环节： ①盐酸的纯度。在酸水解时，某些氨基酸，如酪氨酸，能与盐酸中的氯等卤素反应生成卤代物而影响测定结果。因此应选择优级纯盐酸，并加以苯酚以抑制上述反应。 ②氮气保护。在高温水解时，空气或试剂中的氧的存在会使氨基酸进一步分解，影响水解回收率。 ③水解温度和时间。常采用的酸水解条件是110℃，24h。若提高水解温度，水解时间可缩短，但对个别氨基酸的水解回收率有较大影响。

38. 2） 碱水解 • 条件：分析色氨酸可采用碱水解法。一般与5mol/L NaOH煮沸10-20小时。 • 优点：水解彻底，色氨酸不被破坏，水解液清亮。 • 缺点：产生消旋产物，破坏的氨基酸多。

39. 3） 酶水解 某些氨基酸对酸或碱不稳定，在酸或碱水解时易被破坏，某些蛋白质样品在酸或碱水解不完全，影响某些氨基酸的回收率。对这些样品可采用酶水解法。酶水解法可定量测定天东氨酸、谷氨酸和色氨酸。 • 条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温37～40℃， pH值5～8 。 • 优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。 • 缺点：水解不完全，中间产物多。

40. 净化 食物中含有大量非氨基酸的其它成分如有机酸、脂肪、蛋白质等，它们都会干扰氨基酸的色谱测定。因此在测定之前，需要脱蛋白及浓缩、净化等样品前处理。 ⑴ 脱蛋白质 沉淀法是脱除蛋白质的经典方法。常用的蛋白质沉淀剂主要为有机溶剂，如乙腈、甲醇、乙醇和丙酮等；有机酸和无机酸，如苦味酸、三氯乙酸、高氯酸等；盐类，如碳酸铵、汞盐、钨酸盐等。采用有机溶剂和酸处理的样品最适合于HPLC分析。

41. ⑵ 固相萃取法 固相萃取法常用氧化铝、活性碳、硅藻土、离子交换树脂、C18固相萃取柱等，后者的选择性和提取效率高，再现性好，使用方便，为优先考虑选择的固相萃取法。 ⑶ 超滤法 超滤法是使用一种可使样品按照分子量大小进行筛分的过滤膜。大分子的组分被阻留，小分子的组分则通过膜。超滤法特别适合于氨基酸样品前处理中除去蛋白质和微量生物大分子，具有操作简便、回收率高的优点。

42. 5.5.2 气相色谱法 • 由于氨基酸的高极性、低挥发性以及对热不稳定，因此氨基酸在GC分析之前需要衍生化。通常利用氨基酸的羧基和氨基与醇和酸酐作用，即酯化反应和酰化反应，得到易挥发、热稳定性好的衍生物，适合于GC分析。

43. 氨基酸的衍生过程有两步反应，首先在酸性、加热条件下，氨基酸分子中的羧基与醇发生酯化反应，然后氨基与酸酐发生酰化反应，生成N(O,S)-酰氨基酸酯。氨基酸的衍生过程有两步反应，首先在酸性、加热条件下，氨基酸分子中的羧基与醇发生酯化反应，然后氨基与酸酐发生酰化反应，生成N(O,S)-酰氨基酸酯。 H3NCHCOOH +R’OH H3NCHCOOR’+H2O H3NCHCOOR’+ (R’’CO)2O R’’CONHCHCOOR’+R’’COOH+H+ + + H+ R R + R R

44. 酯化反应的醇一般是异丙醇、正丙醇、异丁醇或正丁醇，用盐酸作为酸性催化剂，酰化剂通常为三氟乙酸酐、五氟丙酸酐。酯化反应的醇一般是异丙醇、正丙醇、异丁醇或正丁醇，用盐酸作为酸性催化剂，酰化剂通常为三氟乙酸酐、五氟丙酸酐。 氨基酸在衍生过程中应注意三个方面： ① 由于酯类衍生物的易挥发性，在蒸发除去酰化试剂时会有损失，因此在衍生化前就要加内标； ②氨基酸在高浓度的醇溶液中溶解度较差； ③玻璃表面的硅羟基会加速N-酰基氨基酸酯衍生物的分解，因此反应瓶表面需硅烷化处理。

45. 气相色谱法测定氨基酸通常采用火焰氢离子检测器（FID）检测，由于FID对碳氢化合物有较高的响应，食品中含有的其它有机酸会干扰氨基酸的测定，而需除去；其次实验用水引入不纯含碳物也影响氨基酸的定量。气相色谱法测定氨基酸通常采用火焰氢离子检测器（FID）检测，由于FID对碳氢化合物有较高的响应，食品中含有的其它有机酸会干扰氨基酸的测定，而需除去；其次实验用水引入不纯含碳物也影响氨基酸的定量。

46. 5.5.3 液相色谱法 柱后衍生法 • 传统的氨基酸分析技术用离子交换色谱分离氨基酸，柱后与茚三酮反应。此法需要专门的氨基酸分析仪。 • 用茚三酮为衍生化试剂常需要采用双波长检测，对仪器要求较高。

47. 柱前衍生法 • 利用RP-HPLC。 • 要求将氨基酸在柱前转化为适合于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物。 • 迄今已报道的柱前衍生试剂有很多，主要有邻苯二甲醛（OPA)、丹酰氯（DNS-Cl）、磺酰氯二甲偶氮苯（DABS-Cl）和异硫氰酸苯酯（PITC）等。

48. 5.5.4 直接测定法 • 大量氨基酸分析方法建立在柱前和柱后衍生化的气相色谱和液相色谱之上。虽然这些方法比经典的离子色谱方法快速且检测限更低，但是这些方法耗时更长。当使用蒸发光散射检测器（ELSD）检测未衍生化氨基酸所需的样品预处理最少，并且可靠和准确。

49. 5.6 蛋白质 测定蛋白质的方法很多，一般是根据蛋白质的理化特性来进行定量的方法，这些方法大致可分为两类： 一类是利用蛋白质共性的方法，如凯氏法、双缩脲法等； 另一类是利用蛋白质中含有特定氨基酸残基的方法，如紫外吸收光谱法、色谱法、染色结合法等。

50. 5.6.1 蛋白质含量的测定 （1）凯氏定氮法 样品中的蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，测出样品转化后的氮含量。