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3. 液相色谱

4. HPLC的环境设置： • HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃；相对湿度<80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。

5. 色谱 石油醚 组分 色素 碳酸钙颗粒 一、色谱起源

6. 液相色谱流程图 色谱柱 检测器 进样器 柱温箱 输液泵 溶剂 数据处理

7. HPLC的分离类型 • 正相色谱 (NP-HPLC) • 反相色谱 (RP-HPLC) • 反相离子对色谱 (RPIC) • 离子交换色谱 (IEC) • 空间排阻色谱 (SEC) • 手性化合物分离模式 (Chiral separation mode)

8. 液相色谱按两相极性不同分为: • 正相色谱 • 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序

9. 正相HPLC 色谱柱 • 硅胶型 • 氰基型 • 氨基型 糖类分析 • 二醇基型 蛋白质分析 -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) Si Si Silica gel Modified Si

10. 反相HPLC 色谱柱 • C18 (ODS) type • C8 (octyl) type • C4 (butyl) type • Phenyl type • TMS type • Cyano type Non-polar property -Si-C18H37 Si

11. 流动相 流动相选择注意事项： • 纯度：采用“HPLC”级溶剂 • 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 • 对试样有适宜的溶解度 • 溶剂粘度要小 • 与检测器相匹配 • 流动相配制时的顺序

12. 溶 剂 等 级 • 水的等级 • 纯化水 • 蒸馏水 • 去离子水 吸光率 去离子水 纯化水 波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物

13. HPLC用水可以通过以下几个方面来得到： • 1 专门的纯水机或超纯水机； • 2 去离子水重蒸； • 3 二次或三次重蒸水； • 4 采用类似家用的纯水机； • 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； • 6 其它途径；

14. 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 • 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。

15. 溶剂前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。

16. 样品过滤头的类型： 30mm内径： 适用于大进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。 13mm内径： 适用于范围广的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料为纤维素。 3mm内径： 适用于小进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格。处理样品体积为7µl。

17. 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。

18. 溶剂前处理 脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动 返回

19. 泵头 马达和凸轮 单向阀 柱塞杆 10 -100uL 柱塞杆密封圈 柱塞往复泵

20. 岛津VP系列输液泵 目的 单元 流速范围 特性和应用 分析LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析 *所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度

21. 柱温箱 进样器 输液泵 检测器 色谱柱 单一或混合溶剂 等度洗脱

22. A 色谱柱 检测器 进样器 柱温箱 A 泵 B浓度 B B泵 时间 梯度洗脱

23. 等度洗脱 MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长 分离度差 MeOH / H2O = 8 / 2 ( column : ODS type )

24. 梯度洗脱 95% MeOH 浓度 30%

25. 高压/低压梯度系统 高压梯度 低压梯度 混合器 低压梯度比例阀 脱气机

26. 高压/低压梯度系统 • 高压梯度系统 • 梯度准确度好 • 系统复杂 (需两台或三台泵) • 低压梯度系统 • 系统简单 • 需在线脱气机 • 存在时间滞后效应 返回

27. 进样器 • 自动进样器 • 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入 返回

28. HPLC六通阀进样器的使用及保养 • 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。

29. 工作原理 • 手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出； • 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。

30. 手动进样器的原理图 装填状态 进样状态 返回

31. 虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。

32. 手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。

33. 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。

34. 可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10μl的定量环，实际是9μl还是1lμl并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10μl的定量环，实际是9μl还是1lμl并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。

35. 进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。

36. 进样体积与响应值关系 检测器响应值 全量注入 部分注入 3倍定量管体积 定量管体积的一半 进样体积 返回

37. 泵的保养 • 使用流动相尽量要清洁； • 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； • 流动相交换时要防止沉淀； • 避免泵内堵塞或有气泡； • 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；

38. 色谱柱 ODS柱的使用注意点： 1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5 返回

39. 柱的保养： • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； • 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； • 要注意流动相的脱气； • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； • 进样样品要提纯； • 严格控制进样量； • 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； • 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； • 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；

40. 流动相注意点 • 离子对试剂的使用 • 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始 • 流动相平衡 加快平衡时间 • 异丙醇的使用

41. LC检测器 • 紫外可见检测器（UV/VIS） • 二极管阵列检测器（PDA） • 示差检测器（RID） • 电导检测器（CDD） • 荧光检测器（RF） • 电化学检测器（L-ECD） • 质谱检测器（MS） • 蒸发光散射检测器（ELSD）

42. 反相色谱分析时 添加10-30 mM 三乙胺(triethylamine) 可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾 添加1% 醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾 三乙胺(triethylamine) 也用于正相色谱中,使硅胶部分去活性, 以获得化合物合适的保留时间

43. 线路过滤器 单向阀 检测器 柱塞密封圈 吸滤头 维护流程图

44. 管线选择 • 材料 不锈钢 Teflon PEEK (聚醚醚酮) • 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.

45. 管线材料 • 不锈钢 (可用于所有连接) • 能承受几千 kg/cm2压力 • 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) • PEEK(可用于所有连接) • 能承受高达 250 kg/cm2压力 • 可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 • 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等 • Teflon(用于柱后阻尼管、反应管和排液管) • 化学惰性大 • 能承受 5 kgf/cm2压力

46. 接头 • 不锈钢接头 / 垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接 • 能承受 400 kgf/cm2压力 • 一旦固定，垫圈不可再动 • PEEK接头 主要用于色谱柱、检测器的连接 • 易于安装 • 能承受 250 kgf/cm2压力 • 容易产生死体积 垫圈 不锈钢接头 PEEK接头

47. 吸滤头 材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗

48. T泵：串联式往复泵 D泵：并联式往复泵 单向阀

49. 吸液冲程 排液冲程 出口单向阀 宝石球 抛光面 泵头 流动相 进口单向阀 单向阀 单向阀原理 单向阀结构 球座

50. 单向阀清洗 故障：宝石球或球座受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施： • 打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 • 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗