Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

1. Univerzita Pavla Jozefa ŠafárikaKatedra biochémie Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mgr. Kamil Tóth …Danišovce 2006 Yellowstone 1969...

2. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●biokatalyzátory chemických reakcií ●metabolické premeny urýchľujú ~ 106 x ●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek. ●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK ●enzýmy proteíny Enzýmy

3. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●ich štruktúra je tvorená: kofaktor apoenzým ●aktívne miesto – oblasť katalýzy ●evolúcia – selekcia katalytických skupín ●vysoká špecificita ”key and lock” ●prevaha nekovalentných interakcií ●dynamické štruktúry

4. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●metabolické dráhy ●imunitný systém ●proteosyntetický aparát... ●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov ●niektoré organizmy sa prispôsobili extrémnym podmienkam... Kde sa enzýmy vyskytujú? ... všade tam, kde prebieha život

5. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Acidofily pH 1-5 Barofily Halofily 1-700 atmosfér >2M soľ Psychrofily (Mezofily) 25-40°C -10 až 20°C 50-105°C Termofily termofily 50-80°C hypertermofily >80 °C Extrémofily ●odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť „dynamická povaha termostability“

6. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov NADH oxidáza z Thermus thermophilus kooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth, Nemecko ●50 kDa homodimér ●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér ●NADH dehydrogenáza ●pI 9,26 ●hypertermofil Topt.=82°C ●neznáma fyziologická funkcia

7. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát ●až  65% flavoproteínov viaže FAD ako kofaktor Biologická všestrannosť ●Citrátový cyklus ●oprava poškodených reťazcov DNA ●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká ●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín ●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek NADH oxidáza je flavoproteín

8. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov flavínmononukletid(FMN) adenozínmonofosfát (AMP) D-ribitol adenozín ribolflavín izoalloxazínflavín Štruktúra FAD flavínadenindinukleotid (FAD)

9. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém ChinónSemichinón Hydrochinón „Motýlí ohyb“ zbalená forma rozbalená forma

10. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Ciele práce: A ●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy B ●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov ●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti ●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych miestach

11. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Význam: ●základný výskum ●biotechnologický priemysel

12. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov i) zásahom do primárnej sekvencie – bodové mutácie ii) pôsobením externe modulovaných podmienok ? soli Hofmeisterovej série ...ako je to in vivo Na+, Gdm+, NH4+, Li+, K+ ,Cs+ ●priama interakcia s proteínom ●cytozol 300mg proteínov/ml ●nepriama s molekulami H2O ●existencia voľnej H2O? Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy

13. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mechanizmus pôsobenia KM,NADH KM,FMN rovnica Michaelis-Mentenovej ●v ~ aktivita enzýmu ●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát

14. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●pozitívne nabité aktívne miesto ●nešpecifická aktivácia ●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta ●nízka koncetrácia solíelektrostatické interakcie ●vysoká koncetrácia solíHofmeisterov efekt

15. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH ●charakteristika interakcie enzým-substrát ●konformačná bariéra ●pre 2M soli K+Na+Cs+> NH4+>Li+>> Gdm+

16. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií ●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru ●chaotrópne katióny znižujú afinitu Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát ●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu

17. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2 ●gyračný polomer: Rg v Å B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach ●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD

18. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank) ●55 ortológov ●100 kofaktorov ●priemerné rozlíšenie ~ 2.06 Å 98% oxidoreduktázy 46% α/β štruktúra Databáza flavoproteínov

19. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov ● kritérium rozlíšenia: < 2Å ● 24 flavoproteínov ● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach sila interakcie vodíkovej väzby: izoalloxazín<pyrofosfát~adenozín<ribityl

20. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov

21. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov o ●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a gyračného polomeru Rg (R=0.844) o Charakteristika rozbalenej konformácie FAD ● ASA – plocha prístupná pre rozpúšťadlo ●  Rg -gyračný polomer ●  schopnosť tvorby vodíkových väzieb

22. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Zhrnutie: • úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série • 537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov • určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest 75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii

23. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ...čo do budúcna? ●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus ●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach ●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu

24. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD. RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD. Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi Poďakovanie Vám za vašu pozornosť!