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Gasphasensequenzer

Gasphasensequenzer. N-terminale Sequenzanalyse. EDMAN-ABBAU. Zyklischer Prozess letzte N-terminale Aminosäure abgespalten + identifiziert Reaktion aus 3 Schritten: Kupplung Spaltung Konvertierung . Edman-Reagenz: Phenylisothiocyanat PITC an freie N-terminale Aminogruppe gekoppelt.

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Gasphasensequenzer

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Presentation Transcript

  1. Gasphasensequenzer N-terminale Sequenzanalyse

  2. EDMAN-ABBAU • Zyklischer Prozess • letzte N-terminale Aminosäure abgespalten + identifiziert • Reaktion aus 3 Schritten: • Kupplung • Spaltung • Konvertierung

  3. Edman-Reagenz:Phenylisothiocyanat PITC an freie N-terminale Aminogruppe gekoppelt. • bei 40-55 Grad / ca. 15-30 Minuten • Addition nur an unprotonierte Aminogruppe • pH ca. 9 durch alkalische Puffer KUPPLUNG

  4. PTC = disubstituierter Thioharnstoff (Phenylthiocarbamoylpeptid PTC) KUPPLUNG

  5. Nebenreaktion: alkal. katalysierte Hydrolyse v. PITC zu Anilin. - Anilin mit freier Aminogruppe mit PITC zu Diphenylthioharnstoff (DPTU) = Nebenprodukt des EA KUPPLUNG

  6. DPTU = Diphenylthioharnstoff NEBENREAKTION

  7. Unpolares Lösungsmittel (z.B. Essigsäureethylester) löst DPTU von Protein/ PTC – Gemisch heraus (Protein=hydrophil, löst sich nicht) KUPPLUNG

  8. wasserfreie Säure (z.B.Trifluouressigsäure) zum getrockneten PTC-Peptid = nucleophiler Angriff d. Schwefels an der Carbonylgruppe d. 1. Peptidbindung Abspaltung der 1. AS (Heterozyklisches Derivat: Anilinthiazolinon (ATZ)-AS) SPALTUNG

  9. Anilinthiazolinon (ATZ-AS) SPALTUNG

  10. S=nucleophil genug zur Ringbildung, O kann nur kuppeln, keinen Ring bilden • Inertgasatmosphäre, verhindert Austausch S O • Abdampfen der flüchtigen Säure SPALTUNG

  11. Kleine relativ hydrophobe ATZ-AS mit hydrophoben Lösungsmittel extrahiert (Chlorbutan, Essigsäureethylester) Anderes Löslichkeitsverhalten der AS als Peptid SPALTUNG

  12. ATZ- Aminosäure = instabil wird in stabiles Derivat Phenylthiohydantoin (PTH-AS) Aminsäure umgewandelt. • ATZ-AS mit wässriger Säure geöffnet • bei erhöhter Temperatur zur stabileren PTH-AS umgelagert. KONVERTIERUNG

  13. KONVERTIERUNG PTH-AS = Phenylthiohydantoin-Aminosäure

  14. Peptid (um 1 AS gekürzt) getrocknet • Neuer Reaktionszyklus PTH-AS chromatographisch im Vergleich zur Referenzprobe mit allen bekannten AS identifiziert + quantifiziert. KONVERTIERUNG

  15. Identifizierung der Aminosäuren: • PTH-AS = typisches Absorbtionsspektrum: 269nm e=33.000 mol –1 • Bestimmungsgrenze (noch sicher quantifizierbar) = 1pmol (mit chromatographischen Methoden) IDENTIFIZIERUNG

  16. Seit 1950 Versuch Edman-Abbau in Empfindlichkeit zu steigern. fluoreszierende Isothiocyanate als Kupplungsreagenzien ABER keine bessere Reaktionsausbeute  • Allgemeines Problem: Trennung der normalerweise großen und sich durch Fluorophor chromatographisch ähnlich verhaltenen fluoreszierenden AS-Derivaten EDMAN-ABBAU

  17. Neben chromatographischen Identifizierungen auch Massenspektros- kopie (MS) • Ethylen-N,N,N trimethylamino-phenyl-isothiocyanat als Kupplungsreagenz (guter Nachweis mit MS) • Tsugita: statt Hydrolyse (Konvertierung) = Aminolyse • Einsatz von fluoreszenzmarkierten AS • Nachweis bis in Attomol-Bereich! ABER: Reaktionsbedingungen schwierig EDMAN-ABBAU

  18. Qualität: • Repetitive yield • Problem: Anzahl der pro Zyklus vollständig abgebauten Polypeptide nehmen rapide ab. • Nach einigen Abbauschritten sogar größere Anzahl unvollst. abgebauter Moleküle Komplexes PTH-AS Gemisch PTH-Analyse schwierig AUSBEUTE

  19. Sequenzierungsgrenze: 15% der eingesetzten Peptidmenge • je später 15% Grenze erreicht, desto längere Sequenz erhalten. • heutige Ausbeute (Automatisierung des Edman Abbaus) mehr als 90% (ca. 95% = 30-40AS) AUSBEUTE

  20. Repetitive Yield AUSBEUTE

  21. 1967: Automatisierung: Verluste beim manuellen Hantieren vermindert • 1000 fache Empfindlichkeitssteigerung von ca. 100nmol Ausgangsmaterial auf heute 10pmol durch: • Umstellung von Dünnschichtchromatographie auf Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) • techn. Verbesserung der Automaten • Gasphasensequenzierung EDMAN-ABBAU

  22. Edman-Sequenator: • Lösungsmittelfördereinheit (transportiert Lösungsmittel + Reagenzien durch N-Druck über elektronisch aussteuerbaren Ventilblock zum Reaktionskompartiment) • dort Kupplung und Spaltung • abgespaltete ATZ-AS in gekühlten Fraktionskollektor gesammelt • Konvertierung und Identifizierung offline SEQUENATOR

  23. Moderne Sequenzer ähnlich: 1976 Wittmann-Liebold = automat. Konvertierung -ATZ-AS in Gefäß -dort Konvertierung -PTH-AS Identifizierung online • Reaktionskompartiment geändert, soll Protein immobilisieren Kontrolle der Reaktion SEQUENZER

  24. Aubau des Edman-Sequenators SEQUENATOR

  25. Problem: Proteine in vielen Lösungsmitteln oder Reagenzien des Edman-Abbaus (Base, Säure) gut löslich. • Reagenzien, die Auswaschen des Proteins verhindern PROBLEM

  26. Spinning Cup Sequenator • Festphasensequenzer • Gasphasensequenzer • Biphasischer Säulenreaktor Spinning Cup Sequenator: rotierender Becher, Zentrifugalkraft hält Protein an der Wand Festphasen-Sequenator: Protein über AS-Seitenkette o. freies C-Ende an Matrix (Polystrol, Glas) gebunden >96% Ausbeute, Nachteil: gebundene AS nicht sequenziert SEQUENZER

  27. Biphasischer Säulenreaktor: Reaktionskompartiment aus 2 chromat. Säulen 1. Reversed-Phase: bindet Protein in wässrigen Lösungsmitteln 2. Silikal: bindet Protein in organ. Lösungsmitteln Säure/Base: Silikalsäule  Reversed-Phase Org. Lösungsmittel: Reversed-Phase  Silikalsäule -für die Extraktion von kleinen hydrophoben Nebenprodukten, >95% Ausbeute SEQUENZER

  28. Gasphasensequenzer: 1981 von Hewick • Protein auf chemisch inerte Glasfritte appliziert (evtl. mit Trägersubstanz, z.B. Polybren) • beide Reagenzien, in denen aufgetragenes Protein löslich ist (Base/Säure) = gasförmig gefördert  Argon- oder N-Strom durch wässrige Trimethylaminlösung bzw. Trifluoressigs., dann zur Reaktionskammer geleitet SEQUENZER

  29. im Reaktionskompartiment gewünschte Säure/Base Bedingungen, aber kein Auswaschen! • Reaktionsnebenprodukte und ATZ-AS in organ. Lösungsmitteln (flüssige Phase) extrahiert Protein darin nicht löslich • totvolumenfreie Ventilblöcke optimale Anpassung an geringe Proteinmengen (<100pmol ) SEQUENZER

  30. Sonderform:Pulsed-Liquid –Sequenzer = Gasphasensequenzer, Säure in flüssiger Form, schnellere Spaltungsreaktion • erfordert genaue Dosierung, um Protein mit Säure zu benetzen, aber nicht wegzuspülen Verkürzung des Edman-Abbaus auf 30 min SEQUENZER

  31. Reaktionskompartimente SEQUENZER

  32. Probleme bei der Sequenzanalyse • Probleme der Probe • Probleme der Sequenzierung - der Probe: • Probe muss N-Terminal einheitlich (rein) sein • Kontamination von Salzen, Detergentien, freien AS interferieren schon in kleinen Mengen mit Reaktionen des Edman-Abbaus oder verhindern Extraktion. PROBLEME

  33. Gasphasensequenzer: • entsprechende Probenvorbereitung • letzter Schritt der Peptidreinigung möglichst salzfrei! (Reversed-Phase-HPLC unter flüchtigen Lösungsmitteln) • adsorbtive Immobilisierung an hydrophobe Membran • durch Elektroblot des Proteingels auf PVDF-Membran oder hydrophob modifizierte Glasfasern) PROBLEME

  34. Probenaufgabe • Glas, Eppis mit >95% Ameisensäure behandeln, Proteine dürfen nicht binden! N-terminale Blockierung • kein freies N-Ende, keine Kupplung an Aminogruppe • ca. 50% aller natürl. Vorkommender Proteine = N-terminal modifiziert (Acetylierung, Formylierung) • kann selten enzym. oder chem. entfernt werden Fragmentierung, nur innere Sequenzen PROBLEME

  35. Quantifizierung • nur 50% der eingesetzten Proteinmenge sequenzierbar • wenn geringere PTH-AS-Menge als erwartet:  Proteinmenge weniger als vermutet  Proteingemisch mit N-terminaler Blockierung, Verunreinigung PROBLEME

  36. Probleme der Sequenzierung • AS durch aggressive Reaktionsbeding. des EA zerstört:  kleine Nebenpeaks im HPLC-Chromatogramm • modifizierte AS durch basische/saure Reaktionsbdeingungen täuschen unmodifizierte vor! • Fehlinterpretation: von modifizierten AS keine Standards PROBLEME

  37. zunehmender Untergrund durch labilere Peptidbindung, bei Spaltung werden Aspartylbindungen weniger hydrolysiert (Spaltungsreaktion)  freier N-Terminus Sequenzierung Detektion im HPLC-Chromatogramm • nicht gesamte Proteinmenge kann sequenziert werden! Anfangsausbeute: initial yield = ca. 50% PROBLEME

  38. Reaktionszeit, Menge, Lösungsmittel, Durchflussgeschwindigkeit, Temperatur = großen Einfluss auf Qualität! Reinheit der Chemikalien: -strenge Qualitätskontrollen, sonst Störpeaks HPLC-Systems: (High Performance Liquid Chromatography) • für PTH-AS Trennung in hohem Empfindlichkeitsbereich = technische Schwierigkeiten PROBLEME

  39. Microbore-Trennsäulen • ca. 1pmol • genaue Lösungsmittelgradienten und Temperaturen, damit PTH-Laufverhalten nicht geändert! • Finanzielle und zeitliche Schäden bei falschen Sequenzen • Als Kontrolle: MS, Kapillarelektrophorese KONTROLLE

  40. Analyse der 5 ersten Aminsäuren 350 € Analyse der 6 bis 25 Aminsäuren 60 € SDS PAGE Trennung und Übertragung auf PVDF 240 € Gasphasensequenzierung PREISE

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