Polimeráz láncreakció (PCR)

1. Polimeráz láncreakció (PCR) Készítette: Lakatos Valéria Biológia-Háztartásökonómia szakos hallgató III. évfolyam

2. A polimeráz láncreakció Angol név: Polymerase Chain Reaction (PCR) K. Mullis- 1985 Előnye az óriási sokszorozó képessége Molekuláris biológiai alkalmazásai: • DNS próbák előállítás hibridizációhoz • Módosított DNS előállítása • Klónozás • DNS szekvenálásához minta előkészítése • Genetikai betegségek kimutatása • Fertőzést okozó élőlények detektálása betegtől vett mintákból • Igazságügyi orvostani vizsgálatok • Rokonsági viszonyok, stb.

3. A PCR elve A DNS függő polimeráz (primer DNS szál megkettőzését végző enzimek) reakciót két megfelelő oligonukleotid primer jelenlétében többször megismételve az eredeti DNS szekvencia egy része megsokszorozható. Ehhez szükség van DNS targetre, DNS polimerázra és két olyan oligonukleotid primerre, amely a DNS két szálával hibridizálnak úgy, hogy a 3’ végük egymással szembenéz.

4. A reakció lépései • 1. A kettősszálú DNS denaturálása hőkezeléssel (95 Celsius fok) • 2. A targettel komplementer két oligonukleotid hibridizálása az egyes DNS szálakhoz úgy, hogy az egyikük az egyik, másikuk a másik szálhoz kötődjön. A kapcsolat stabilizálásához az elegyet le kell hűteni és az oligonukleotidokat nagy feleslegben kell alkalmazni • 3. Új DNS szálak szintézise dNTP és DNS polimeráz segítségével • 4. A ciklus megismétlése. Ekkor a sokszorozandó DNS szakasz megduplázódik

6. Plató effektus • Kb. 106-szoros sokszorozás • Exponenciális növekedés leáll • Magyarázat: DNS olyan mértékben koncentrálódik, hogy gyakoribb a hosszú szálak renaturálódása mint az oligonukleotiddal történő hibridizáció

8. Egy tipikus PCR ciklus hőmérsékleti profiljai • Denaturálás 92-95 Celsius fokon • Primerek hibridizálása az oligonukleotidok olvadáspontjától függő hőmérsékleten • DNS szintézis 72 Celsius fokon • Újabb hődenaturálás

10. Optimalizálás Legfontosabb tényezők: • 20-30 nukleotid hosszúságú primerek tervezése • Optimális reakcióközeg beállítása • Nagy tisztaságú dNTP oldatok használata • Elvileg egyetlen kettős szálú DNS molekula elegendő a másolás beindításához, de ekkor magasabb ciklus szám szükséges • Rendkívül fontos a szennyezések és keresztszennyezések elkerülése (nem kívánatos szennyező DNS sokszorosítása)

11. Felmerülő problémák: • A Taq polimeráz nem rendelkezik ellenőrző aktivitással • Primerek aspecifikus kötődése – félrevezető eredmény • A primerek összekapcsolódásával un. primer dimer keletkezhet • Alkalmazásának korlátot szab, hogy csak akkor használható, ha már van megbízható szekvencia információnk vagy a nukleinsav vagy a fehérje szintjén

12. PCR alkalmazásai • Fertőző ágensek kimutatása • Szövetminta in situ vizsgálata • Kettős szálú DNS megsokszorozása • mRNS átalakítása cDNS-sé, ennek megsokszorozása • Fehérjék meghatározása immundetektálás specifitásával ötvözve • Mutációk detektálása

13. PCR szerepe a DNS szekvenálásban • Aszimmetrikus PCR. • Lényege: a primereket nem 1:1 arányban alkalmazzuk, hanem az egyik primert 100x-os feleslegben visszük be a reakcióközegbe. Ilyenkor a PCR sokszorozás addig tart, amíg a kisebb koncentrációjú primer el nem használódik, ezt követően csak a feleslegben jelenlévő primer működik, így a szintézis egyszálú termékhez vezet.

14. Irányított mutagenézis A PCR primerek és a target DNS szekvenciája nem kell, hogy szükségszerűen 100%-ig komplementer legyen. Lehetőség van eltérő szekvenciák beépítésére. Ezek a szekvenciák a sokszorosított DNS részévé válnak és maguk is sokszorozódnak.

15. Új restrikciós hely kiépítése PCR segítségével a sokszorozott szekvencia végére olyan restrikciós helyet építhetünk be, amely a természetes DNS-ben fordul elő. Ez akkor előnyös, ha a termék végét restrikciós enzim kezeléssel „ragadóssá” akarjuk tenni pl. klónozás céljából.

17. G-C kapocs készítése A PCR reakció egyik primerjének 5’ végére G és C gazdag mesterséges szekvencia illeszthető. Ez erős hidrogénhíd kapcsolatot hoz majd létre. A PCR termék a natív DNS szakaszhoz képest stabilabban kapcsolódik össze. Denaturáló gradiens során a PCR termék nem esik szét. Felhasználható pontmutációk detektálásának érzékennyé tételére.

18. Pontmutáció létrehozása Az oligonukleotidban tudatosan beépíthetünk egy, a target szekvenciával nem komplementer nukleotidot, és így jól meghatározott helyen pontmutációt idézhetünk elő.

20. Egyéb módszerek • Géntechnológiai manipulációk (inzerció, deléció, rekombináció) • Módosított nukleutidok beépítése • Részben vagy egyáltalán nem ismert DNS szekvenciák sokszorozása • cDNS végek gyors erősítése (RACE) • Szomszédos DNS szakaszok sokszorozása • RNS kvantitálási módszerei (Northern analízis, In situ hibridizáció, Rnasa protection assay, microarray, Reverz traszkriptciós PCR)

21. Összegzés A fenti példákkal illusztráltam a PCR sokoldalúságát. A fejlesztés még korán sem zárult le, újabb és újabb technikákat vezetnek be különleges és speciális problémák megoldására. Mindez azt bizonyítja, hogy a Mullis által felfedezett egyszerű sokszorozási reakció döntő befolyást gyakorolt a molekuláris biológia módszertanára.

26. Köszönöm a figyelmet!