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1. 化学化工学院 School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University 2014/9/14 纳米组装血红蛋白的 直接电化学和催化研究 国家级化学实验教学示范中心 LOADING 综合化学实验 以能力培养为核心 ，知识传授、能力培养、素质提高全面协调发展。 全面科学教育要求教学既传授科学知识和技术，更训练科学方法和思维，还培养科学精神和品德。

2. /实验目的/ • 制备模拟生物膜的MWNT-CS薄膜，实现血红蛋白 (Hb)直接电子传递 • 研究Hb-MWNT-CS膜修饰玻碳电极对过氧化氢的 电催化行为并探讨了催化机理 • 测定血红蛋白催化过氧化氢的米氏常数

3. /实验原理/ • 血红蛋白（Hemoglobin, Hb） 由两条α和两条β多肽链构成的四聚体

4. /实验原理/ • 分子结构庞大，电活性中心不易暴露 • 在电极的吸附变形而造成电极表面的钝化 在一般固体电极的电子传递速率很低，电子传递受阻 将Hb直接吸附固定在经羧基化处理的多壁碳纳米管 和壳聚糖薄膜中，实现了Hb的直接电子转移

5. /实验原理/ • 米氏常数的测定 • 米氏常数(Km) 等于酶促反应达到其最大速率一半时的底物浓度[S] • 表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱 稳态条件下，类似于酶促反应的电催化过程，根据 Lineweaver-Burk方程可得 以1/i~1/[S] 作图，利用斜率和 截距可以计算出米氏常数

6. 170℃ 4h 冷却至室温 /实验步骤/ • 可溶性多壁碳纳米管的制备 1000~2000 rpm 离心3min 去离子水洗涤到 pH值5~6 110℃烘箱干燥1h 20mg MWNT 30mL 30% HNO3 红外灯下恒重 红外表征 未处理的MWNT也要做红外表征

7. /实验步骤/ • 玻碳电极的预处理和循环伏安表征 • 预处理：玻碳电极用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉抛光 成镜面，依次用无水乙醇及蒸溜水超声洗净，晾干 • 循环伏安表征 电解质：1.0mM K3Fe(CN)6 0.1M KCl 工作电极：玻碳电极 参比电极：饱和甘汞电极 对电极：铂丝电极 通氮除氧15min以上， 扫描速率：10、40、60、80 100、200 mV/s 记录：+0.6 ~ −0.20 V 扫描循环伏安图

8. 超声分散 /实验步骤/ • 纳米组装血红蛋白酶修饰电极的制备 1 mgMWNT 4mgHb 加入到1 mL 上一步溶液 20mg壳聚糖超声溶解于 2mL1%冰醋酸溶液pH=5 3μL Hb-MWNT分散液 滴涂于电极表面，晾干2h 得Hb-MWNT-GC修饰电极 不加MWNT以相似方法制得Hb-GC修饰电极为对照

9. /实验步骤/ • 过氧化氢的催化和米氏常数的测定 • 在电解池中放入10mL 0.1M pH=7.0 的磷酸缓冲溶液， 通氮除氧15min以上，加入不同溶度的过氧化氢溶液： 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、 0.40、0.45、0.50 mM，分别记录在100 mV/s扫描速率 从+0.3 ~ −0.80 V扫描循环伏安图

10. /注意事项/ • 玻碳电极表面要处理干净，否则会阻碍修饰膜的 电子传递 • 缓冲溶液中的空气要彻底排除，防止氧气对过氧 化氢的催化干扰

11. /数据处理/ • 计算电极的粗糙因子 • 计算出米氏常数

12. /讨论与思考题/ • 比较处理前后多壁碳纳米管的FT-IR谱图并解释 水溶性原因 • 血红蛋白修饰电极上的直接电化学行为讨论 • Hb-MWNT-CS和Hb-CS修饰电极对过氧化氢催化 电流大小的比较及讨论 • 纳米材料在电极表面修饰层内作用和原因是什么 • 探讨血红素蛋白质对过氧化氢的催化机理 • 试说明米氏常数Km的生物学意义

13. /参考资料/ • DAI Z H, XU X X, JU H X. Direct electrochemistry and electrocatalysis of myoglobin immobilized on a hexag- onal mesoporous silica matrix [J]. Anal. Biochem. 2004, 332: 23-31. • DAVIS J J, GREEN M L H, HILL H A O, et al. The im- mobilisation of proteins in carbon nanotubes[J]. Inorg. Chim. Acta 1998, 272: 261-266. • 鞠熀先. 电分析化学与生物传感技术[M]. 北京：科学 出版社，2006