1 / 27

SEPARAREA CELULELOR

SEPARAREA CELULELOR. CRITERII DE SEPARARE. Proprietati fizice: Dimensiuni (filtrare, centrifugare) Densitate (centrifugare in gradient de densitate) Dispersia luminii (citometrie de flux) Proprietati biochimice: Markeri de suprafata specifici Markeri citoplasmatici. SEPARAREA CELULELOR.

Audrey
Download Presentation

SEPARAREA CELULELOR

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SEPARAREACELULELOR

  2. CRITERII DE SEPARARE • Proprietati fizice: • Dimensiuni (filtrare, centrifugare) • Densitate (centrifugare in gradient de densitate) • Dispersia luminii (citometrie de flux) • Proprietati biochimice: • Markeri de suprafata specifici • Markeri citoplasmatici

  3. SEPARAREA CELULELOR • Purificarea unor celule de interes • Selectie negativa: • ~ Depletie • Indepartarea celulelor nedorite • Selectie pozitiva: • ~ Purificare • Pastrarea celulelor dorite

  4. CONDITII DE FIABILITATE • Pastreaza integritatea celulelor • Nu altereaza statusul de activitate al celulelor • Rapida (evitarea leziunii celulare) • Eficienta

  5. PROPRIETATI • Yield = (numar de celule dorite din solutia rezultata) / (numar de celule dorite din proba initiala) • Puritate = (numar de celule dorite din solutia rezultata) / (numar total de celule din solutia rezultata)

  6. PROPRIETATI Separarea celulelor In Out • Nin = CDin + CNin • Nout = CDout + CNout • Yield = CDout / CDin • Puritate = CDout / Nout

  7. METODE DE SEPARARE • Pe baza diferentelor de densitate: • Separarea mononuclearelor prin sedimentare libera in mediu cu Dextran • Separarea mononuclearelor pe gradient de densitate • Pe baza proprietatilor biologice: • Separarea mononuclearelor pe baza aderentei la suprafete de plastic • Pe baza markerilor de suprafata specifici: • Sortarea cu citometrul de flux

  8. DIFERENTE DE DENSITATE • Utilizate frecvent pentru celule sanguine •  (hematii, PMN-uri, celule moarte)  deplasare mai rapida in camp gravitational •  (limfocite, monocite)  deplasare mai lenta • Metode diferite: • Acceleratia gravitationala / centrifuga • Sedimentare libera / gradient de densitate

  9. SEDIMENTARE LIBERA IN MEDIU CU DEXTRAN • Sange heparinat : Dextran 50% = 3:1 • Se incubeaza 1 ora la 37°C • 2 straturi: • Superior: mononucleare (limfocite, monocite) • Inferior: eritrocite • Se recolteaza stratul superior cu o pipeta • Dezavantaje: • Separare grosiera • Puritate mica • Avantaje: • Ieftina

  10. SEPARAREA PE GRADIENT DE DENSITATE • Gradient de densitate = mediu cu masa moleculara mare, care functioneaza ca un separator – permite trecerea particulelor mici si grele (nu si a celor mari si usoare) • Ficoll-Hypaque • Ficoll-Odiston • Sepcel

  11. SEPARAREA PE GRADIENT DE DENSITATE • Se introduce gradientul intr-un tub de centrifuga • Sangele heparinat se prelinge in tub • Se centrifugheaza • 4 straturi: • Plasma + trombocite • Mononucleare - limfocite (“buffy coat”) • Gradient • Hematii, PMN-uri, celule moarte

  12. FICOLL-HYPAQUE Plasma + trombocite Sange Limfocite Limfocite Ficoll-Hypaque Ficoll-Hypaque Ficoll-Hypaque Hematii, PMN-uri Hematii, PMN-uri

  13. FICOLL-HYPAQUE

  14. MARKERII DE SUPRAFATA • Rozetarea: • Suspensia de mononucleare obtinuta in gradient de densitate + hematii de oaie  agregate de LT care cuplau hematiile de oaie prin CD2 • Dezavantaje: • Lipsa de stabilitate a rozetelor (se desfac la centrifugare) • Numar mic de celule

  15. SORTAREA CELULELOR • Separarea unei (sub)populaţii celulare dintr-un amestec: • Mărime • Granularitate • Antigene de suprafaţă • Celule (in suspensie) + AcM (specifici unui marker de suprafata si marcati fluorecent)

  16. ETAPE • Marcarea cu AcM+fluorocromi • Identificarea celulei –e de interes? • Încărcare cu sarcini pozitive/negative/fără • Câmp magnetic – deflectare spre tuburi colectoare • Centrifugare (aducere la concentratia dorita)

  17. + SORTAREA CELULELOR LASER 488 nm Senzor FS Detector de fluorescenţă - Plăci încărcate magnetic Tuburi de colectare

  18. APLICATII • Indepartarea celulelor tumorale in transplantul autolog de celule stem • Indepartarea fibroblastilor care contamineaza o biopsie de cartilaj • Selectia de hepatocite • Selectia de celule hematopoetice CD34+

  19. TRANSPLANTUL ALOGEN DE CELULE STEM

  20. TESTUL DE PROLIFERARE LIMFOCITARA • Activarea limfocitara = proces fiziologic care survine in urma contactului dintre un limfocit si Ag specific • Blastogeneza = limfocite  limfoblasti • Sinteza  de fosfolipide • Permeabilitate  la cationii divalenti • Activarea adenilat ciclazei •  AMPc intracelular • Sinteza  de ADN, ARN, proteine

  21. ACTIVAREA LIMFOCITARA • Test in vitro • Masoara capacitatea functionala a LB si LT de a raspunde la stimularea Ag • Stabilirea imunitatii in: • Imunodeficiente • Sindroame autoimune • Boli infectioase • Tumori

  22. MITOGENI SI ANTIGENE • Mitogen = substanta care activeaza nespecific o paleta larga de clone limfocitare • Mai frecvent mitogeni: • Raspuns rapid, intens, usor de cuantificat • Fitohemaglutinina, pockweed mitogen, proteina A stafilococica, streptolizina S • Antigene: • Activeaza doar limfocitele specifice • PPD, Ag Candida, streptokinaza, toxoid tetanic, virus Vaccinia, virus Herpes simplex

  23. ACTIVAREA LIMFOCITARA • Se recolteaza “buffy coat” • Se aduce la 106 celule/ml • Se adauga mitogen/antigen • Se incubeaza • 2 eprubete in paralel: 1 stimulat, 1 nestimulat

  24. CUANTIFICAREA PROLIFERARII LIMFOCITARE • Proportia blastilor in populatia de limfocite • Fazele ciclului celular: • G0: faza de repaus, ADN ~ 2n • G1: faza de activare, ADN ~ 2n • S: faza de sinteza, ADN ~ 2n  4n • G2: faza premergatoare mitozei, ADN ~ 4n • M: mitoza ADN ~ 4n • Stare de repaus  ADN ~ 2n • Stare activata  ADN ~ 4n

  25. CUANTIFICAREA PROLIFERARII LIMFOCITARE • Se lizeaza membrana celulara  suspensie de nuclei • ADN + propidium iodid (fluorocrom) • Se analizeaza proba la citometrul de flux • Grafic • Indicele de proliferare (IP) S + G2/M IP = X 100 G0/G1 + S + G2/M

  26. G0 G1 G2 M 4N 2N ANALIZA ADN M G0 G2 G1 Evenimente s s 0 200 400 600 800 1000 Cantitatea de ADN

  27. 300 225 150 75 0 ANALIZA ADN Evenimente 0 200 400 600 800 1000 4N 2N Fluorescenţă PE

More Related