Uso del Termociclador – T100 PCR Thermal Cycler-BIORAD

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA MANEJO DEL TERMOCICLADOR - T100 PCR Thermal Cycler – BIORAD Presentado por: Walcona Llano, Juan Danny Docente: Dr. Herbert Soto Hernández Curso: Biotecnología Fecha de entrega: 22/09/2023

2. 1.INTRODUCCIÓN Un termociclador es un aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para la amplificación de diversas hebras de ADN en la técnica de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) o para reacciones de secuencia con el método de Sanger. El modelo más común consiste en un bloque de resistencia eléctrica que distribuye una temperatura homogénea a través de una placa durante tiempos que pueden ser programables, normalmente con rangos de temperatura de 4 °C a 96 °C donde ocurre la desnaturalización, hibridación y extensión de una molécula de ADN. Dado que las reacciones incubadas en el aparato son en soluciones acuosas, suelen incluir en la tapa una placa calentada constantemente a 103 °C para evitar la condensación del agua en las tapas de los tubos donde ocurre la reacción, y así evitar que los solutos se concentren, lo que modificaría las condiciones óptimas para la enzima polimerizante (Taq Polimerasa) y la termodinámica del apareamiento de los iniciadores conocidos como primers o cebadores. Desde hace algunos años se ha implemetado un nuevo método para cambiar la resistencia de estos termocicladores, utilizando para ello la tecnología o efecto Peltier (Descubierto en 1834) aprovechando las propiedades de los semiconductores. El efecto Peltier hace referencia a la creación de una diferencia de temperatura debido a un voltaje eléctrico. Esto ocurre cuando una corriente se hace pasar por dos metales o semiconductores conectados por dos “junturas de Peltier”. La corriente propicia una transferencia de calor de una juntura a la otra: una se enfría, mientras que la otra se calienta. Este material ofrece mejor uniformidad en la temperatura y rampas de incremento y decremento de la temperatura mucho más pronunciadas, obteniendo mejores resultados en los procesos de la PCR. Hoy día, se ha implementado en los laboratorios un Termociclador en Gradiente. La PCR de gradiente es actualmente el método que se utiliza para seleccionar las condiciones térmicas óptimas de la reacción. Un gradiente de temperaturas programado libremente hasta 20°C no sólo permite optimizar la temperatura de renaturalización, sino también todos los pasos de temperatura de un protocolo de la PCR en las aplicaciones más complejas.

3. Gracias a la tecnología de pendiente constante, siempre se utilizan índices de calentamiento y refrigeración constantes, de forma que los resultados del experimento gradiente se pueden realizar con sencillez y precisión en aplicaciones rutinarias. En la búsqueda de mejorar la precisión, exactitud y homogeneidad de la temperatura también se han introducido metales como el oro, la plata y otras aleaciones en los bloques de los pozos, logrando estabilidad y reproducibilidad en los ensayos. 2.OBJETIVOS •OBJETIVO GENERAL 1.Identificar el uso y manejo adecuado del termociclador T100 PCR Thermal Cycler - BIORAD •OBJETIVO ESPECIFICO 1.Instruir sobre los pasos a realizar para una correcta calibración y modificación de los parámetros a usar 2.Identificar los errores a cometer durante el uso y la calibración del termociclador T100 PCR Thermal Cycler – BIORAD 3.MARCO TEORICO TERMOCICLADOR - T100 PCR Thermal Cycler – BIORAD El termociclador T100 es un equipo compacto de 96 pozos que ofrece resultados rápidos, confiables y está equipado con una pantalla táctil (touch screen) que permite el fácil e intuitivo manejo del equipo, es compatible con USB lo que permite almacenar protocolos y hacer respaldos. La pantalla de 5.7” despliega gráficos de alta resolución para una programación intuitiva. Los botones de la pantalla responden al tacto tanto con guantes como sin ellos. Despliega los protocolos en un formato gráfico de fácil programación. Permite manejar los datos de manera organizada y personalizada para diferentes usuarios. Existen protocolos pre-instalados para que los investigadores accedan rápidamente a ellos. Es compatible con memorias USB para un manejo más fácil de los archivos ya que se pueden transferir protocolos entre termocicladores T100, hacer respaldos de los protocolos en una PC o almacenar un número ilimitado de protocolos al extender la memoria del termociclador.

4. Tiene la capacidad de hacer gradiente térmico lo que permite la optimización de ensayos de PCR en una sola corrida. Con esta característica se pueden probar 8 temperaturas simultáneamente. El gradiente se puede crear en un intervalo de 1-25°C, esta característica viene instalada de fábrica. Asi mismo El termociclador T100 es un instrumento compacto, fácil de usar, con desempeño confiable propio de una marca líder en PCR. Su pantalla de control al tacto ahorra tiempo en la programación y manejo de archivos. El gradiente térmico permite una rápida optimización de los protocolos de PCR en una sola corrida. Su diseño confiable está basado en la vasta experiencia de 20 años de Bio-Rad en el mercado de PCR desarrollando termocicladores de alta calidad, asegurando desempeño consistente que es necesario para experimentos cruciales. Características principales del Termociclador Bio-Rad T100 ❖Bloque de termociclado: El T100 tiene un bloque de termociclado que puede acomodar tubos de reacción o placas de 96 pocillos, lo que permite realizar múltiples reacciones de PCR simultáneamente. ❖Programación flexible: El instrumento permite la programación de una amplia gama de protocolos de PCR, incluyendo PCR estándar, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y PCR digital. ❖Pantalla táctil: La interfaz de usuario suele estar equipada con una pantalla táctil que facilita la configuración y el seguimiento de las reacciones de PCR. ❖Control preciso de la temperatura: El T100 ofrece un control preciso de la temperatura, lo que es esencial para ciclos de PCR eficientes y reproducibles. ❖Software de control: Bio-Rad suele proporcionar software de control para el T100, lo que permite programar, monitorear y analizar los datos de PCR. ❖Gradiente de temperatura (opcional): Algunos modelos del T100 pueden incluir la función de gradiente de temperatura, que permite probar diferentes temperaturas en diferentes pocillos para optimizar las condiciones de amplificación.

5. Aplicaciones y usos del termociclador T100 i. Amplificación de ácidos nucleicos (PCR) ii. Clonación y análisis de genes. iii. Análisis de expresión genética. iv. Análisis mutacional v. Secuenciación de ciclos vi. Los investigadores de ciencias biológicas de todo el mundo utilizan el termociclador T100 en su rutina diaria. El termociclador T100 es elogiado por ser fácil de usar, confiable y divertido de usar a través de la interfaz de pantalla táctil. 4.MATERIALES Y MÉTODOS a)Termociclador El Termociclador Bio-Rad T100 es un instrumento utilizado en biología molecular y genética para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácidos nucleicos conocida como PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Bio-Rad es una empresa reconocida en el campo de la biología molecular y proporciona una variedad de equipos y reactivos para investigaciones en este ámbito. El Termociclador Bio-Rad T100 es uno de los modelos de termocicladores producidos por Bio-Rad y ofrece diversas características que lo hacen adecuado para aplicaciones de PCR. Imagen 01. El Termociclador Bio-Rad T100

6. b)Micro-tubos Recipientes de un solo uso diseñados para almacenar cantidades de líquido de microlitros a mililitros. Estériles o no estériles, con o sin una variedad de tapones (de rosca , con sujeción, a presión) y pueden ser adecuados para utilizarse en microcentrífugas. Imagen 02. microtubo c)Micropipetas Es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Imagen 03. Microtubo

7. d)Puntas para micropipetas Las puntas para micropipeta se utilizan para tomar una pequeña muestra de líquido o solución, utilizadas principalmente en investigación. Fabricadas con polipropileno con filtro, no estéril, autoclavables hasta 121°C. Imagen 04. Puntas para micropipetas e)Placa de PCR es un consumible desechable de laboratorio popular ampliamente utilizado en aplicaciones relacionadas con la medicina, la genética, la inmunidad, la bioquímica y otros campos Imagen 04. Placa de pcr PROCEDIMIENTO PARA USO Y CALIBRACION Primer paso Se buscan un lugar seguro para colocar el termociclador, alejando de todo objeto que podría alterar o dañar las pruebas.

8. Segundo paso Conectar al alimentador de energía eléctrica y dejar que se inicialice por si solo, solo asegurándonos que la tapa superior este en su lugar correcto Tercer paso Configuramos el termociclador siguiendo paso a paso el protocolo de uso, sumado a ello configuraremos los termociclos que se usaran con nuestra muestra, además de considerar las pautas del especialista del laboratorio. Cuarto paso En tanto se calibra la configuración de los termociclos se puede ir preparando la muestra de ADN y ARN que se usaran en la amplificación del PCR, siguiendo las precauciones adecuadas sin alterar la muestra. Sin embargo, como en esta ocasión no se está realizando una prueba real, solo se realiza una simulación del acto mencionado Quinto paso Una ves colocada la muestra a analizar, se cierra cautelosamente la tapa, seguidamente se presiona el botón iniciar el ciclo. El instrumento (termociclador) iniciara con el procesamiento de PCR con los parámetros previamente configurados considerando los ciclos definidos Sexto paso Una concluida el análisis el termociclador emitirá una señar de conclusión y en la pantalla se mostrará. Abra suavemente el termociclador y retire la placa usada con la muestra.

9. 5.CONCLUSIONES ❖Es enriquecedora la experiencia de conocer nuevos instrumentos y mecanismos de evaluación usados en el laboratorio de biotecnología, porque nos ayuda a entender la forma en la que se analiza un PCR ❖El termociclador T100 PCR Therma Cycler de Bio-Rad es un instrumento muy versátil en uso, sumado a ello su manejo es no muy complicado, además la veracidad de sus resultados es confiable. Asi mismo es de suma importancia un manejo adecuado de las muestras porque se podría alterar los resultados. También se debe de considerar la facilidad con la que se trabaja en su interface y la múltiple gama de aplicaciones de PCR. ❖Múltiples investigadores usan este instrumento porque permite analizar hasta 1000 muestras y todo ello solo con el único fin de estudiar el materia genético y diversificar los conocimientos científicos.

10. 6.BIBLIOGRAFIA ❖León-Luna, D., Fajardo-Loyola, A., Yareta-Yareta, J., Burgos-Espejo, A., Peralta- Siesquen, C., Galarza-Pérez, M., & Marcos-Carbajal, P. (2021). Caracterización molecular de enterobacterias multirresistentes en dos departamentos de la selva peruana.Biomédica, ❖https://www.onelab.com.ar/termociclador-bio-rad-t100 ❖https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/que-es-y- como-funciona-un-termociclador ❖https://www.sarstedt.com/es/productos/laboratorio/pcr-biologia- molecular/placas-pcr/