Cytogenetik

1. Cytogenetik Genvej til karyotyper Gå direkte til dette Cytogenetiske analyser (banding teknik, FISH) og karyotype Kromosomabnormaliteter (numeriske og strukturelle)

2. Cytogenetiske analyser: nogle indikationer • Diagnosticering af fænotypisk abnormalitet (fx hos nyfødt) • Risikovurdering af forældre til nyfødt med fænotypisk abnormalitet med henblik på senere graviditet • Prenatal diagnostik, herunder undersøgelse for Downs syndrom, samt undersøgelse for arvelige sygdomme som fx DiGeorge syndrom og Williams syndrom • Cancer; fx leukemier med henblik på klassifikation, prognose og behandlingsregime

3. Cytogenetiske analyser: fakta om kromosomers opbygning og organisering, som udnyttes ved cytogenetisk analyse • Fakta: et kromosom består af et langt DNA molekyle (dobbelt strenget), som er oprullet omkring histoner og andre proteiner. (figur 2.4 i Medical Genetics) → Kromosomer kan synliggøres/analyseres ved at benytte • farvning af DNA og/eller proteiner med histokemiske farvestoffer (herunder banding teknik) • mærkede DNA fragmenter (prober) som genkender og hybridiserer til komplementære sekvenser i kromosomets DNA streng (in situ hybridisering) • Fakta: kromosomerne er mere eller mindre kondenserede i løbet af cellecyklus. I mitosens metafase er kromosomerne maximalt kondenserede, og kan ses lysmikroskopisk ved HE farvning, mens de i interfasen cytologisk fremstår som eukromatin (lyse områder i kernen) og heterokromatin (mørke områder). I interfasen er de enkelte kromosomer dog lokaliserede i kerneområder. → Metafase kromosomer fra celler i deling kan anvendes til at beskrive en persons samlede kromosomudseende, kaldet karyotypen, mens interfasekromosomer kan anvendes til analyser, hvor man leder efter en bestemt mutation.

4. Cytogenetiske metoder: Prøvemateriale (blod, væske og vævsprøver) Prøvematerialet • kan indeholde levende celler, som kan bringes til deling (fx blod, moderkagebiopsi) → metafase kromosomer kan frembringes • kan bestå af celler uden eller med insignifikant delingsevne (fx andre væv end blod samt fixeret væv) → celler er i interfase, og kun interfase kerner ses Hvis du vil se flere metafasekromosomer (farvet med Giemsa), interfasekerner samt hetero- og eukromatin i interfasekerner kan du klikke her Se billeder Billede fra ældre Abbotts præsentation: udlånt af U. Larsen, Abbotts Giemsa farvet præparat www.cytochemistry.net

5. Cytogenetiske analyser:Kort om fremstilling af metafase kromosomer • Vævsprøve med levende celler dyrkes i kultur 48-72 timer (periferale leukocytter i blod), idet celledeling stimuleres med et mitogen (fx phytohæmaglutinin) • Cellernes metafase blokeres med fx colcemid, som hæmmer mitotisk spindle dannelse. • Cellerne(kernerne) høstes ved bl.a. centrifugering, og placeres på objektglas • Hypotonisk saltvand får kernemembranen til at sprænges, så metafasekromosomerne spredes på objektglasset, og under lufttørring bindes til objektglasset. • Kromosomerne visualiseres efter kromosom banding teknik eller FISH procedure, og fotograferes med henblik på karyotypering (karyotypebestemmelse)

6. Cytogenetiske metoder: kort om kromosom banding teknik • Princip: forskellige områder af kromosomerne farves forskelligt af et givet farvestof, hvorved et karakteristisk båndmønster fremkommer på forskellige kromosom par. • Ofte benyttes G banding, som fremkommer ved farvning med Giemsa farve efter trypsinbehandling (MG fig. 6.3). • Vha båndmønstre kan man identificere præcise dele af kromosomerne til brug ved karyotypering; fx 7q12.2 (pil) Subbånd Bånd Region Arm 3 2 1 2 2 2 1 1 p 5 4 3 2 1 1 1 1 1 2 3 1 q 1 2 3 2 1 2 3 4 1 1 2 3 2 2 Kromosom 7; G banding teknik Tilbage til karyotyper

7. Cytogenetiske analyser: karyotype og karyotypering • Karyotype: en ordnet præsentation af et individs metafase kromosomstruktur baseret på en celles metafasekromosomer arrangeret efter størrelse og centromér placering. Kønskromosomer placeres nederst til højre. (se MG fig. 8-8, MD fig. 6.1) • Karyotypering: navn for den proces, hvorved et individs karyotype fremkommer. Karyotypering kan ske på baggrund af kromosom banding teknik og/eller flourescens in situ hybridisering (FISH). • Karyotypen angives i henhold til international standard nomenklatur. Til dette Til dette Til start

8. Cytogenetiske analyser: Karyotypering i praksis • 20-30 metafaser tælles • 10-25 af disse karyotyperes; dvs opsættes som vist i MG figure 6.1 og figure 6.7 • Kromosomerne tælles (parres) og båndene analyseres • Cytogenetisk diagnose afgives (ISCN) Figur fra Abbotts præsentation: udlånt af U. Larsen, Abbotts Tilbage til strukturelle abnormiteter

9. Cytogenetiske analyser: International standard cytogenetisk nomenklatur(ISCN) • Se MD tabel 8.3 for liste over forkortelser • Se MG tabel 6.1 for eksempler • Generelt angives (Kromosom antal pr. celle), (kønskromosomer), (alle observerede abnomaliter) Se eksempler i MG figur 8-10 og 8-12, eller tag en slapper og leg lidt med karyotyper: karyotypering

10. Forskellige områder på et kromosompar eller forskellige kromosompar farves afhængigt af hvilken fluoroscerende probe, der vælges til hybridisering. Almindelige er: Centromer prober (CEP) og telomer prober (TEP) (korte ~5 kb): hybridiser specifikt til henholdsvis centromeret og telomeren på et kromosom, og er kromosomspecifikt. Locus specifkke prober: korte (60-200 kb) prober, som genkender sekvenser i fx et gen Kromosomprober: dækker hele kromosomer (prober op til 40 Mb) Resultat af farvningen ses ved flourescensmikroskopi. Cytogenetiske metoder: kort om flourescens in situ hybridisering (FISH)

11. Cytogenetiske teknikker:Sammenligning af Geimsa bånd og FISH signaler G-bånd LSI HER-2/neu CEP 17 Begge figurer fra Abbots præsentation om FISH; udlånt af U. Larsen. • Bemærk, at FISH kan anvendes diagnostisk på både interfasekerner og metafasekromosomer

12. Cytogenetiske teknikker:Princippet bag FISH Figur lånt fra ældre Abbots præsentation; efter aftale Tilbage til karyotyper

13. Kromosomabnormaliteter:typer og hyppighed • Abnormt kromosomantal(benævnes også genom mutationer eller numeriske abnormaliteter) eller • Abnorm kromosomstruktur(benævnes også kromosom mutationer eller strukturelle abnomaliteter) • Hyppigheder for nogle af disse ses i MG tabel 6.2 Til start

14. Kromosomabnormaliteter:Numeriske abnormaliteter • Normalt: -Euploid (2 x 23 i mennesket: 2N), - Haploid (antal i kønsceller; 23 hos mennesket: N) • Abnormalt: -Polyploidy (3, 4, eller … x 23: fx 3N) - Aneuploidy (færre eller flere kromosomer end et multiple af 23; fx 2N-1 eller 2N+1)

15. Kromosomabnormaliteter:Numeriske abnormaliteter - aneuploidy • Oftest monosomi eller trisomi af ét kromosompar • Autosomer eller kønskromosomer monosomi: monosomi: oftest letal i forstertilstanden 45,X (Turner syndrom) trisomi: trisomi: især 47,+21; 47,+18; 47,+1347, XXY; 47, XXX; 47XYY • Skyldes oftest meiotisk nondisjunction, men kan også ske i mitosen

16. Kromosomabnormaliteter:meiotisk nondisjunction Se MG figure 6.6 • På venstre side sker nondisjunction i 1. meiotiske deling • Til højre sker nondisjunction i 2. meiotiske deling ▬► Dannelse af kønsceller, som ved befrugtning med en normal kønscelle vil resultere i monosomi eller trisomi hos afkommet

17. 13 (green),21 (red) X (green),Y (red) 18 (aqua) Kromosomabnormaliteter:Screening for aneuploidy i fostervand, moderkagebiopsi eller blod disomy13 trisomy 21 Billeder udlånt af overlæge Carsten Brandt

18. Kromosomabnormaliteter: strukturelle abnormaliteter • Typer: - Translokation (reciprok og i praksis robertsonsk) Balanceret - Inversion - Deletion - Duplikation Ubalanceret - Ring kromosom - Translokation (ikke gensidig udveksling) • Årsager: upræcis parring af kromosomer i meiose samt kromosombrud i meiose og mitose (sker ofte i ”hot spots”) Se tidligere eksempel Se IFISH detektion

19. Kromosomabnormaliteter: Strukturelle abnormaliteter handler også om balance Balancerede x ubalancerede Ex. MG figur 6.14 og 6.15 Ex. Prader Willi syndrom (6.16) Oftest altid forbundet med sygelighed, retardering og øget mortalitet Ofte fuldt forenelige med et normalt voksenliv Abnormal kromosom- parring i meiosen Abnormal kromosom- parring i meiosen Stor risiko for abnormale børn (MG 6.14, 6.16)