METHOD VALIDATION

METHOD VALIDATION การตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ

ความหมาย • METHOD VALIDATION • การยืนยันโดยการทดสอบและมีหลักฐานแสดงว่าวิธีทดสอบเหมาะสมกับความต้องการเฉพาะ • METHOD VERIFICATION • การยืนยันโดยการทดสอบและมีหลักฐานแสดงว่าเป็นไปตามข้อกำหนดที่ระบุ

วิธีทดสอบที่ดีจะต้อง • ได้ผลที่ถูกต้อง • เมื่อทดสอบซ้ำ ยังได้ผลที่ไม่ต่างกัน • ใช้ทดสอบสารที่มีความเข้มข้นน้อยๆ ได้ • บอกได้ว่าความเข้มข้นต่ำสุดที่มีความถูกต้องและแม่นยำเป็นเท่าไร

วิธีทดสอบที่ดีจะต้อง (ต่อ) • บอกได้ถึงช่วงความเข้มข้นที่สามารถทดสอบได้อย่างถูกต้อง แม่นยำ โดยที่ความสัมพันธ์ของค่าที่อ่านได้กับความเข้มข้นมีความเป็นเส้นตรง • สามารถทดสอบได้เฉพาะสารที่ต้องการทดสอบโดยไม่ถูกรบกวนจากสารอื่นที่อยู่ในตัวอย่าง • เมื่อเปลี่ยนเงื่อนไข (condition) ในการทดสอบเล็กน้อย ผลไม่แตกต่าง

ทำไมจึงต้องมีการทำ method validation • ข้อกำหนดของ ISO/IEC 17025 • ความน่าเชื่อถือของผลการทดสอบ • ทราบ conditions ที่ใช้ในการทดสอบ • ทราบข้อจำกัดของวิธีทดสอบ

วิธีทดสอบที่ต้องทำ method validation • วิธีทดสอบที่ใช้ไม่ใช่วิธีมาตรฐาน • - ห้องปฏิบัติการพัฒนาขึ้นเอง • วิธีทดสอบที่ใช้เป็นวิธีมาตรฐาน แต่ • - มีการใช้นอกขอบข่ายของวิธีมาตรฐาน • - มีการดัดแปลงจากวิธีมาตรฐาน

จะต้องทำ method validation เมื่อไร • ก่อนนำไปใช้จริง • เมื่อวิธีที่เคย validate นั้นมีการเปลี่ยนแปลง condition เช่น เปลี่ยนเครื่องมือเป็นต้น • เมื่อมีการทดสอบนอกขอบข่ายจากที่เคย validate

สิ่งที่ต้องเตรียมในการทำ method Validation • เครื่องมือ : ผ่านการสอบเทียบและเหมาะสมต่อการใช้งาน • วิธีทดสอบ : เขียนเป็นลายลักษณ์อักษร • สารมาตรฐาน / สารเคมี : ใบรับรอง สามารถสอบกลับได้ เหมาะสม • ผู้ทดสอบ: ความสามารถ ประสบการณ์ วิเคราะห์ข้อมูล • ตัวอย่าง • งบประมาณ

สิ่งที่ใช้ในการทำ method Validation • Blank : Reagent blank / Sample blank • Fortified sample / Spiked sample • Certified reference material (CRM) • Reference material (RM) • Interlaboratory comparison / Proficiency testing

Blank • Reagent blank - ทดสอบทุกขั้นตอนเช่นเดียวกับการทดสอบตัวอย่าง แต่ไม่ต้องมีตัวอย่าง - interfere จากสารเคมี • Sample blank - วัตถุที่มี matrix เหมือนกับตัวอย่าง แต่ไม่มีสารที่ทดสอบอยู่ในตัวอย่างนั้น - interfere จาก matrix

Fortified / Spiked sample • Fortified sample เติมสารที่ต้องการทดสอบลงในตัวอย่าง • Spiked sample เติมสารใดๆ ลงในตัวอย่าง

Certified reference material (CRM) - วัสดุหรือสารที่มีสมบัติอย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างซึ่งได้รับการรับรองโดยวิธีที่ถูกต้องตามหลักวิชาการ พร้อมกับมีใบรับรองที่สามารถสอบกลับได้ - มี matrix เช่นเดียวกับตัวอย่าง - มีการระบุค่าจริงและค่าความไม่แน่นอน - ผลิตจากหน่วยงานที่หน่วยให้การรับรองยอมรับ

Reference material (RM) - วัสดุหรือสารที่มีสมบัติอย่างใดอย่างหนึ่งหรือหลายอย่างซึ่งมีความเป็นเนื้อเดียวกันและจัดเตรียมมาอย่างดี เพื่อใช้ประเมินวิธีทดสอบ สอบเทียบเครื่องมือ หรือใช้ในการกำหนดค่าให้กับวัสดุอื่น - มี matrix เช่นเดียวกับตัวอย่าง - ห้องปฏิบัติการสามารถเตรียมเอง - ผ่านการทดสอบอย่างน้อย 20 ซ้ำ คำนวณค่าเฉลี่ย และ SD - มีปริมาณเหมาะสมต่อการใช้งานในช่วงอายุการเก็บ

Interlaboratory comparison / Proficiency testing - การเปรียบเทียบผลการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ โดยใช้ตัวอย่างเดียวกัน แต่อาจจะใช้วิธีทดสอบแตกต่างกัน

Interlaboratory comparison • ห้องปฏิบัติการสามารถเตรียมตัวอย่างเอง • จำนวนห้องปฏิบัติการที่เข้าร่วมโครงการจะเป็นเลขคี่ และมักไม่เกิน 10 แห่ง • ห้องปฏิบัติการที่เข้าร่วมโครงการ ควรจะ - ได้รับการรับรอง ISO / IEC 17025 หรือ - มีแนวทางการดำเนินงานตามระบบคุณภาพ หรือ - มีความชำนาญเฉพาะทาง

Proficiency testing • มีหน่วยงานที่ทำหน้าที่จัดเตียมตัวอย่าง ประเมินผลการทดสอบ และจัดส่งผลการประเมิน • ห้องปฏิบัติการจะต้องซื้อตัวอย่างมาทดสอบ • จำนวนห้องปฏิบัติการที่เข้าร่วมโครงการมีจำนวน 10 แห่ง ขึ้นไป • มักเป็นโครงการระดับนานาชาติ

วิธีการคำนวณในการเตรียมสารละลาย standard

สารละลาย (solution) ประกอบด้วย ตัวทำละลาย (solvent) กับ ตัวถูกละลาย (solute) ความเข้มข้นของสารละลาย (concentration) บ่งบอกจำนวนของตัวถูกละลายที่มีอยู่ในสารละลายจำนวนหนึ่งสามารถบอกได้หลายวิธี ได้แก่ 1. %, ppm, ppb:- w/w, v/v, w/v 2. Molarity (Molar = M) :- โมล/ลิตร 3. Normality (Normal = N) :- กรัมสมมูลย์/ลิตร 4. Molality (Molal = m):- โมล/ตัวทำละลาย 1 กิโลกรัม

สารละลายเข้มข้น 5 % สารละลาย 100 ml มีตัวถูกละลาย 5 กรัม สารละลายเข้มข้น 5 ppm สารละลาย 1 ml มีตัวถูกละลาย 5 ไมโครกรัม (g) หรือ สารละลาย 1 L มีตัวถูกละลาย 5 มิลลิกรัม สารละลายเข้มข้น 5 ppb สารละลาย 1 ml มีตัวถูกละลาย 5 นาโนกรัม (ng) หรือ สารละลาย 1 L มีตัวถูกละลาย 5 ไมโครกรัม (g)

สารละลายเข้มข้น 5 M สารละลาย 1000 ml มีตัวถูกละลาย 5 โมล สารละลายเข้มข้น 5 N สารละลาย 1000 ml มีตัวถูกละลาย 5 กรัมสมมูลย์ สารละลายเข้มข้น 5 m มีตัวทำละลาย 1 Kg มีตัวถูกละลาย 5 โมล

Molar จำนวนโมล = นน.สาร / นน.โมเลกุล จำนวนกรัมสมมูลย์ = (นน.สาร / นน.โมเลกุล) x ประจุ = จำนวนโมล x ประจุ Normal N = M x ประจุ หรือ M = N / ประจุ M1V1 = M2V2 เฉพาะกรณีปฏิกิริยา 1:1 N1V1 = N2V2 ใช้ได้ทุกกรณี

สมการเคมี กลุ่มสูตรเคมีที่เขียนขึ้น เพื่ออธิบายการเปลี่ยน แปลงทางเคมีของสารในอัตราส่วนอย่างต่ำที่สุดของจำนวนโมเลกุลของสารเหล่านั้น โดยเขียนสารที่เข้าทำปฏิกิริยาเคมีไว้ทางด้านซ้าย และสารที่เกิดขึ้นใหม่ไว้ทางด้านขวา ใช้เครื่องหมาย + คั่นระหว่างสารและเขียนลูกศรไว้ระหว่างกลางของสาร 2 พวก 2HCl + Ba(OH)2 BaCl2 + 2H2O

กรณีหาความเข้มข้นของสารละลายโดยการไตเตรตกรณีหาความเข้มข้นของสารละลายโดยการไตเตรต

สารละลาย HCl 3 M จำนวน 15 ml ทำปฏิกิริยาพอดีกับสารละลาย Ba(OH)2จำนวน 10 ml จงหาความเข้มข้นของสารละลาย Ba(OH)2เป็น M และ N 2HCl + Ba(OH)2 BaCl2 + 2H2O HCl 3 M =HCl 3 N จาก N1V1 = N2V2 ดังนั้น N1 = N2V2 / V1= 3 x 15 / 10 = 4.5 Normal จาก M = N / ประจุ จะได้ว่า M = 4.5 / 2 = 2.25 Molar

กรณีเตรียมสารละลายจากของเหลว concentrate

กรณีที่สารตั้งต้นที่นำมาเตรียมเป็นของเหลวและระบุค่าความหนาแน่นกรณีที่สารตั้งต้นที่นำมาเตรียมเป็นของเหลวและระบุค่าความหนาแน่น ใช้สูตร V = 100M(MW) / pd โดยที่ V = ปริมาตรของสารที่ต้องใช้ในการเตรียม M = ความเข้มข้นเป็น Molar MW= น้ำหนักโมเลกุล p = เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักของสารที่นำมาเตรียม d = ความหนาแน่น (ความถ่วงจำเพาะ) ของสารที่นำมาเตรียม สูตรนี้ใช้สำหรับเมื่อเตรียมเป็นสารละลายจำนวน 1 ลิตร

จงคำนวณหาปริมาตรของ HCl เข้มข้นที่ต้องใช้ เพื่อเตรียมเป็นสารละลายเข้มข้น 0.1 M จำนวน 1 ลิตร (MW ของ HCl = 36.46, % โดยน้ำหนัก = 37.5 %, ความหนาแน่น = 1.19 จาก V = 100M(MW) / pd = ( 100 x 0.1 x 36.46 ) / ( 37.5 x 1.19 ) = 8.17 ml

กรณีเตรียมสารละลายจากของแข็งกรณีเตรียมสารละลายจากของแข็ง

ต้องการเตรียมสารละลายโซเดียมคลอไรด์เข้มข้น 0.1 M จำนวน 2000 ml จะต้องใช้โซเดียมคลอไรด์หนักกี่กรัม ( MW = 58 ) สารละลายโซเดียมคลอไรด์เข้มข้น 0.1 M หมายถึง สารละลาย 1000 ml มี NaCl 0.1 โมล สารละลาย 2000 ml มี NaCl 0.1 x 2000 / 1000 = 0.2 โมล NaCl 1 โมล หนัก 58 กรัม NaCl 0.2 โมล หนัก 58 x 0.2 = 11.6 กรัม หรือใช้สูตร W = MW x M x V / 1000 = 58 x 0.1 x 2000 / 1000 = 11.6 กรัม

ต้องการเตรียมสารละลาย oxolinic acid เข้มข้น 50 ppm จำนวน 100 ml จะต้องใช้ oxolinic acid กี่กรัม สารละลาย oxolinic acid เข้มข้น 50 ppm หมายถึง สารละลาย 1 ml มี oxolinic acid 50 g สารละลาย 100 ml มี oxolinic acid 50 x 100 = 5000g = 5000 / 106= 0.005 g

กรณีเตรียมสารละลายจากสารละลายความเข้มข้นต่างๆกรณีเตรียมสารละลายจากสารละลายความเข้มข้นต่างๆ

ต้องการเตรียมสารละลาย oxolinic acid เข้มข้น 0.1 ppm จำนวน 25 ml จะต้องใช้สารละลาย oxolinic acid เข้มข้น 10 ppm กี่ ml และกี่ l จาก M1V1 = M2V2 0.1 x 25 = 10 x V2 V2 = 0.1 x 25 / 10 = 0.25 ml จาก 1 ml = 1000 l ดังนั้น 0.25 ml = 1000 x 0.25 = 250 l

กรณีเตรียม fortified sample ที่ความเข้มข้นต่างๆ

ต้องการเตรียม fortified sample ที่ความเข้มข้น 10g / g โดยในวิธีการทดสอบฮีสตามีนจะต้องใช้ตัวอย่าง 5 กรัม ต้องการเตรียม fortified sample ที่ความเข้มข้น 10 g / g หมายความว่า ตัวอย่าง 1 กรัม จะมีฮีสตามีน 10 g ดังนั้น ตัวอย่าง 5 กรัม จะมีฮีสตามีน 10 x 5 = 50 g นั่นคือ จะต้องเติมฮีสตามีนจำนวน 50 g ลงไปในตัวอย่าง 5 กรัม

ซึ่งการเติมฮีสตามีน ทำได้หลายอย่าง เช่น - เติมสารละลายฮีสตามีนเข้มข้น 50g / ml จำนวน 1 ml ลงในตัวอย่าง 5 กรัม หรือ - เติมสารละลายฮีสตามีนเข้มข้น 500g / ml จำนวน 0.1 ml ลงในตัวอย่าง 5 กรัม เป็นต้น โดยคำนวณจาก สารละลายฮีสตามีนเข้มข้น 500 g / ml หมายความว่า มีฮีสตามีน 500 g ในสารละลาย 1 ml ดังนั้น มีฮีสตามีน 50 g ในสารละลาย 1 x 50 / 500 ml = 0.1 ml = 100 l

แบบฝึกหัดการเตรียมสารละลายแบบฝึกหัดการเตรียมสารละลาย 1. ชั่งโซเดียมไฮดรอกไซด์ 80 กรัม ละลายน้ำและปรับปริมาตรเป็น 500 ml อยากทราบความเข้มข้นเป็นโมลาร์ของสารละลายนี้ (น้ำหนักโมเลกุลของโซเดียมไฮดรอกไซด์ = 40) 2. ชั่งกรดเบนโซอิก 1 กรัม ละลายด้วยเมธานอลและปรับปริมาตรเป็น 100 ml อยากทราบความเข้มข้นเป็น ppm ของสารละลายนี้

แบบฝึกหัดการเตรียมสารละลายแบบฝึกหัดการเตรียมสารละลาย 3. มีสารละลายคลอแรมฟินิคอลเข้มข้น 2 ppb อยู่ 3 ml ต้องการเตรียมเป็นสารละลายคลอแรมฟินิคอลเข้มข้น 0.3 ppb จำนวน 10 ml จะต้องใช้สารละลายคลอแรมฟินิคอลเข้มข้น 2 ppb กี่ ml 4. จะเตรียม fortified sample ที่ความเข้มข้น 0.2 g / g ได้อย่างไร (ในวิธีการทดสอบ oxolinic acid จะต้องใช้ตัวอย่าง 5 กรัม)

รายการที่ต้อง Validate (Performance characteristic)

Range&Linearity • Range ช่วงความเข้มข้นที่สามารถทดสอบได้อย่างถูกต้องและแม่นยำ • Linearity ความสัมพันธ์ระหว่างค่าที่อ่านได้กับความเข้มข้นในช่วงที่กำหนด

Range • ทดสอบ reagent blank 1 ซ้ำ • ทดสอบ fortified sample blank  6 ความเข้มข้นๆ ละ1 ซ้ำ • เขียนกราฟระหว่างความเข้มข้น (แกน X) กับค่าที่อ่านได้ (แกน Y) • correlation coefficient (r)  0.995

Range ค่าที่อ่านได้ x x x x x x x ความเข้มข้น 1 2 3 4 5 6 7

แบบฝึกหัด Range ทดสอบ reagent blank, sample blank และ fortified sample blanks ที่ความเข้มข้นต่างๆ ความเข้มข้นละ 1 ซ้ำ ผลเป็นดังตาราง ให้ตรวจสอบช่วงความเข้มข้นที่เป็นเส้นตรง

Linearity • ทดสอบ reagent blank 3ซ้ำ • ทดสอบ fortified sample blank  6 ความเข้มข้นๆ ละ 3ซ้ำ (ภายในช่วง range) • เขียนกราฟระหว่างความเข้มข้น (แกน X) กับค่าที่อ่านได้ (แกน Y) • correlation coefficient (r)  0.995

Linearity ค่าที่อ่านได้ x x x x x x x x x x x x x x x x x x x ความเข้มข้น 1 2 3 4 5 6 7

แบบฝึกหัด Linearity ทดสอบ reagent blank, sample blank และ fortified sample blanks ที่ความเข้มข้นต่างๆ ความเข้มข้นละ 3 ซ้ำ ผลเป็นดังตาราง ให้ตรวจสอบความเป็นเส้นตรง

Outlier • ค่าที่แตกต่างจากค่าอื่นๆ ในกลุ่มข้อมูล • ทดสอบโดยใช้ Grubb’s test Tn = ( Xn – X ) / SD โดยที่ Xn = ค่าที่สงสัย X = ค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูล SD = ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของกลุ่มข้อมูล ถ้า Tn < Tc แสดงว่าไม่แตกต่าง

ตัวอย่าง Outlier ผลการทดสอบฮีสตามีน 11 ซ้ำ เป็นดังนี้ 35, 34, 37, 42, 31, 36, 34, 37, 36, 35 และ 34 ppm จงหาว่ามีค่าใดเป็น outlier หรือไม่ ค่าเฉลี่ย = 35.5 ppm SD = 2.7 ppm Tc ที่ 11 ซ้ำ = 2.23 ค่าสงสัย = 31 และ 42 ppm Tn= ( 31 – 35.5 ) / 2.7 = 1.66 ดังนั้น 31 ไม่เป็น outlier Tn= ( 42 – 35.5 ) / 2.7 = 2.36 ดังนั้น 42 เป็น outlier

Relationship between accuracy and precision Inaccurate imprecise Accurate Precise Inaccurate Accurate precise imprecise

Accuracy / Trueness • การแสดงความใกล้เคียงกันระหว่างค่าเฉลี่ยของผลการทดสอบที่ได้ ( X ) กับค่าอ้างอิง (  ) ของตัวอย่างนั้น • ทั้ง X และ  เป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูล แตกต่างกันที่ •  เป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูลใหญ่ (ประชากร) เช่น ทดสอบ 50 ซ้ำ • X เป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูลเล็ก (ตัวอย่าง) เช่น ทดสอบ 10 ซ้ำ

Accuracy / Trueness x2 x4 x1 x3 N = 50  = (x1 + x2 + … + x50) / 50 x5 x6 xi n = 10 X = (x1 + x2 + … + x10) / 10

METHOD VALIDATION