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미생물을 이용한 축사 파리 및 암모니아 저감 기술의 개발

2003 년도 충북지역환경기술개발센터 최종 평가회 발표자료. 미생물을 이용한 축사 파리 및 암모니아 저감 기술의 개발. 2004. 01. 13. 발 표 자 건국대학교 송 민 동. Introduction. 연구배경. 축사의 파리는 가축 질병을 전염시키는 주요 매개체일뿐만 아니라 가축 및 사람에게 스트레스를 주는 주요 원인 가축 호흡기 발생의 주요 원인인 가축분뇨로부터의 암모니아 저감 필요함 . 지역특성상 환경친화적 축산 요구됨. 연구의 필요성.

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미생물을 이용한 축사 파리 및 암모니아 저감 기술의 개발

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  1. 2003년도 충북지역환경기술개발센터 최종 평가회 발표자료 미생물을 이용한 축사 파리 및 암모니아 저감 기술의 개발 2004. 01. 13 발 표 자 건국대학교 송 민 동

  2. Introduction 연구배경 • 축사의 파리는 가축 질병을 전염시키는 주요 매개체일뿐만 아니라 가축 및 사람에게 스트레스를 주는 주요 원인 • 가축 호흡기 발생의 주요 원인인 가축분뇨로부터의 암모니아 저감 필요함. • 지역특성상 환경친화적 축산 요구됨.

  3. 연구의 필요성 • 축산분뇨에서 발생하는 암모니아는 악취의 가장 큰 원인 • 가축의 호흡기 질병의 원인인 악취제거 필요 • 파리 발생 억제에 따른 질병 사전예방 필요 • 항생제 사용 감소로 환경친화적 축산환경조성 필요 • 충북지역 특성상 환경친화적 축산이 절대적으로 필요

  4. 연구목적 • 축사 파리발생 억제를 위한 미생물의 분리 및 특성 조사 • 축사 암모니아 발생 저감을 위한 미생물의 분리 미생물을 이용한 축사 파리 및 암모니아 저감 기술의 개발

  5. Bacillus thuringiensis의 δ-endotoxin에 관한 연구 현황 균주의 특성 • 일본의 미생물학자가 병든 누에(Bombyx mori)로부터 Bacillus를 분리 (Bacillus thuringiensis : Bt) • Gram-positive bacteria • 결정형태의 insecticidal crystal protein 생산 • δ-endotoxin ; ICPs(Insecticidal crystal proteins) • * Cry1, Cry2, Cry3, Cry4 - Toxic • * cytolysin(cyt) – Non-Toxic

  6. Bacillus thuringiensis의 δ-endotoxin에 관한 연구 현황 연구기작 및 동향 • 살충 특이성을 가진 결정체 단백질의 생산은 포자형성 시 • 서로 다른 단계동안 RNA polymerase의 시그마 인자와 함께, 영양성장과 포자형성 자극 • 포자형성의 개시는 세포내의 GTP 농도에 의해 조절 • δ-endotoxin의 생성은 유도성을 지님 • 현재 국내외적으로 내독소 단백질 분해 미생물에 관한 연구가 활발히 진행 중 • 지금까지 주된 연구 방향은 주로 나비목에 치중되어져 있다 • 파리목에 관한 연구 및 미생물 제제화 연구는 아직 개발단계

  7. 1 연구내용 토양으로부터 유용 균주의 분리 분리 균주의 특성조사 성장곡선 생화학적 특성 전자현미경을 이용한 형태학적 특성 다양한 항생제에 대한 최소억제농도 (MIC) 조사 분리 균주의 동정 delta-toxin의 정제 및 특성 정제산물

  8. 2 Crystal protein 특성조사 SDS-PAGE cry gene profile 분석 Multiplex PCR Endospore 및 crystal protein 생산조건 확립 분리 균주의 효소활성 측정

  9. Soil 1g 0.1M sodium acetate in 10ml NB Spreading on GYS medium vortex Shaking incubation for 6hr at 30℃ Heating for 10min at 100℃ Incubation for 24hr at 30℃ Spreading on nutrient agar (NA) Bacillus thuringiensis strain selection Subcultured Bacillus thuringiensis k-1 Isolation of Bacillus thuringiensis Strain

  10. 1ml Shaking incubation at 37℃ Inoculation in 10ml NB medium Shaking incubation for 3days at 30℃ in GYS medium (until 107 to 108 spores/ml) pellets supernatant Centrifugation at 10,000g for 20min at 4℃ Three times washing with dH2O and sample dilution (10배, 100배) Insect Bioassay against fly larvae (M. domestica) Insect Bioassay for B. thuringiensis Selection M. Domestica (larvae) were obtained from a pig farm near Chungju city (Korea) Subcultured Bacillus thuringiensis k-1

  11. Table 1. Bio-toxicity of Bacillus thuringiensis k-1 against fly larvae (M. domestica)

  12. Growth curve of Bacillus thuringiensis k-1 Use of Media : Nutrient Broth (NB, 0.3% beef extract, 0.5% peptone) Culture Condition : 48hr, 37℃ Stationary phase Fig. 1. Growth curve of Bacillus thuringiensis strain k-1

  13. Characteristics Bacillus thuringiensis k-1 Gram staining + Motility + Cell form Rod Spore formation + Catalase + Voges-Proskauer + Acid from glucose + Beta-Galactosidase + Arginine dihydrolase - Lysine decarbosylase - Ornithine decarboxylase - Citrate utilization + H2S production - Urease - Tryptophan deaminase - Indole production - Nitrate reduction + Gelatin hydrolase + Biochemical Characteristics of B. thuringiensis k-1 Use of Identification Kit : API CHB 50 kit and Medium Culture Condition : 24hr, 37℃ Table 2. Morphological and biochemical properties of Bacillus thuringienis k-1

  14. Electron Microscopy (TEM, Transmission Electron Micrographs) Strain k-1 was grown for 3days in GYS medium at 30 ℃ Sample was blocked in 4% agar Sample was fixed with Karnowsky`s fixative and then postfixed in 1% OsO4 Sample was dehydrated through an ethanol-propylene oxide series and embedded in Epon 812 Fig. 2. Transmission electron micrographs of sporulating of Bacillus thuringiensis k-1 amplified 25,000× (A). Parasporal crystal (c) and spore (e). Thin sections were cut on ultramicrotome, stained with 1% uranyl acetate and lead citrated Photographed

  15. 1000ug/ml 500ug/ml 250ug/ml 125mg/ml 62.5ug/ml 31.3ug 15.6ug 7.8ug 3.9ug Shaking incubate, 18hrs, 37℃ 1000ug/ml 500ug/ml 250ug/ml 125mg/ml 62.5ug/ml 31.3ug 15.6ug 7.8ug 3.9ug MIC value Antibiotics susceptibility of B. thuringiensis k-1 The test was performed with the use of serial 2-fold dilutions of each antibiotic as described by Cleeland et al. The resistance of Bacillus thuringiensis k-1 against antibiotics was examined after cultivation for 18hr at 37 ℃. Inoculationof Bacillus thuringiensis antibiotics 1.95ug 0ug 1.95ug 0ug

  16. Table 4. Determination of minimum inhibitory concentration of various antibiotics against B. thuringiensis k-1, B. thuringiensis subsp. kurstaki (HD-1) and B. thueingiensis subsp. israelensis (HD-522).

  17. Purification of insecticidal proteins from strain k-1 B. thuringiensis was grown for 3 days in the GYS medium at 30℃ and 180rpm until complete autolysis was achieved. Purification crystal proteins was carried out by discontinuous sodium bromide (NaBr) gradients of 30% to 70%. 130kD 80kD 60kD Fig. 3. SDS-PAGE of Bacillus thuringiensis k-1 crystal proteins purified. M, molecular marker; arrows indicate Cry proteins of ~130, ~80, ~60kDa.

  18. Multiplex PCR for rapid determination of cry genes The extended multiplex PCR screening is a rapid method for detection and differentiation of Bacillus thuringiensis field strains and for prediction their insecticidal activities in order to direct them for subsequent toxicity assays against Lepidoptera, Coleoptera, and Diptera. The 10 primers contained eight forward primers and two reverse primers for cry1 gene determination used in this study. To identify cry4, one forward and one reverse primer used in reaction. Table 5. The optimal conditions of polymerase chain reaction (PCR).

  19. Fig 4. PCR survey of B. thuringiensis k-1 and B. thuringiensis subsp. kurstaki for cry1 contents. Total DNA samples from B. thuringiensis k-1 and B. thuringiensis subsp. kurstaki were analyzed by PCR with a mixture of cry1 specific primers. Lane M: Bio basic 100bp-1kb ladder; lane 1, B. thuringiensis k-1; lane 3, B. thuringiensis subsp. kurstaki ;  M: Bio basic 100bp-1kb ladder

  20. Inoculationof Bacillus thuringiensisk-1 1. Direct spreading in 10ml various media Spreading on NA medium Shaking incubation for 8h, 12h and 16h at 30℃ 2. Heating for 10min at 100℃ Incubation for 12h at 30℃ Total and endospore forming cell counting Culture conditions for viable cell growth and endospore formation (crystal protein)

  21. Table 6. Viable cell and endospore forming cell in various culture conditions ( CFU/ml )

  22. Enzyme activities of Bacillus thuringiensis k-1 Table. 7 Screening media and dyes used for the detection of various enzyme activities 1Nutrient agar (0.3% beef extract, 0.5% peptone, 1.5% agar) 2Carboxymethyl cellulose (medium viscosity) Table. 8 Enzyme activities of Bacillus thuringiensis k-1 ++++ represents excellent clear zone formation; ++ good; + fair

  23. 암모니아 저감을 위한 복합효소 생산 미생물의 분리 및 동정 토양으로부터 유용 균주의 분리 및 선발 효소활성 측정 분리 선발 균주의 특성 조사 형태학적 특성 생화학적 특성 분리 선발 균주의 동정

  24. Soil 1g in 9ml 0.85% NaCl Spreading on nutrient agar medium vortexing Shaking incubation for 6hr at 37℃ Incubation for 24hr at 37℃ Inoculation on enzyme screening mediums (amylase, cellulase, and protease) Incubation for 12hr at 37℃ Clear zone detection Identification Isolation of the strain having multi-enzyme activities

  25. Enzyme activities of Bacillus sp. strains Table. 9 Screening media and dyes used for the detection of various enzyme activities 1Nutrient agar (0.3% beef extract, 0.5% peptone, 1.5% agar) 2Carboxymethyl cellulose (medium viscosity) Fig 5. Protease, cellulase, and amylase activities of 1st isolated strains

  26. Table 10. Enzyme activities of 1st-selected microorganisms 1The rate of growth was evaluated after 12hr on nutrient agar 2+++ represents excellent growth 3+++ represents excellent clear zone formation on screening medium ++; good, +; fair, -; no clear zone formation

  27. Protease Cellulase Amylase Fig 5. Protease, amylase, and cellulase activities of the finally isolated 5-1

  28. Characteristics 5-1 Gram staining + Motility + Cell form Rod Spore formation + Catalase + Voges-Proskauer + Acid from glucose + Beta-Galactosidase + Arginine dihydrolase - Lysine decarbosylase - Ornithine decarboxylase - Citrate utilization + H2S production - Urease - Tryptophan deaminase - Indole production - Nitrate reduction + Gelatin hydrolase + Identification of the selected strain Use of Identification Kit : API CHB 50 kit and Medium Result: Bacillus subtilis Table 11. Morphological and biochemical properties of 5-1

  29. 결 론[PART I] 미생물을 이용한 축사 파리 저감 기술의 개발 • 파리유충에 활성을 나타내는 δ-endotoxin 생산 B. thuringiensis균주 분리 및 동정(형태학적, 생화학적 특성조사) 완료 • δ-endotoxin 단백질 정제, 특성조사 및 보유 유전자 검색 완료 • 파리유충 외피분해를 위한 chitinase 생산 미생물 분리 확보

  30. 결 론[PART II] 미생물을 이용한 암모니아 저감 기술의 개발 • 축 분뇨의 암모니아 발생 저감을 위해 우선적으로 각종 효소활성이 높아 사료첨가 시 사료의 단백질 이용효율 제고를 통한 축 분내 암모니아 발생 저감을 목적으로 하는 미생물 균주 분리 • 효소활성이 가장 우수하며 urease활성이 없는 (암모니아로의 전환 없음) 5-1 균주 최종선발 및 동정완료(Bacillus subtilis) • 암모니아의 질산화에 관여하는 Denitrobacter sp. 및 암모니아와 함께 분뇨냄새의 주 원인물질인 휘발성지방산과 이산화황을 이용하는 광합성세균(photosynthetic bacteria) 확보

  31. 본 과제 성과물 • 논문 1 편 (한국 학술진흥재단 등재학술지 이상) • 특허출원(진행 중)

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