第九章

第九章 发酵过程控制

本章内容 一、概述二、代谢调控在发酵过程控制中的应用三、温度对发酵的影响及其控制四、pH对发酵的影响及其控制五、溶解氧对发酵的影响及其控制六、CO2和呼吸熵对发酵的影响及其控制七、基质浓度对发酵的影响及补料控制八、高密度发酵及过程控制九、泡沫对发酵的影响及其控制十、自动控制技术在发酵过程控制中的应用

一、概述1.过程控制的重要性 生物因素：菌株特性(营养要求、生长速率、呼吸强度、产物合成速率) 传递性能物理：n、T、Ws 化学：pH、DO、浓度过程控制的意义：最佳工艺条件的优选（即最佳工艺参数的确定）以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的控制。 • 决定发酵单位(水平)的因素设备性能：外部环境因素工艺条件

2.发酵过程控制的一般步骤 确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，获取最适水平或最佳范围建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程最优控制

3.参数检测 • 代谢参数按性质可分为三类： • 物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等 • 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、 pH、产物浓度、核酸量等 • 生物参数：菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等

3. 参数检测 • 参数按获取方式可分为两类：如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等如摄氧率(γ)、呼吸强度(QO2)、比生长速率（μ) 、体积溶氧系数(KLa)、呼吸熵(RQ)等。 • 直接参数： • 间接参数：将直接参数通过公式计算获得的参数，

3.参数检测 • 参数的测量形式 • 离线测量：基质（糖、脂类、无机盐等）、前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸、氨基酸等） • 在线测量：如T、pH、DO、溶解CO2、尾气CO2、黏度、搅拌转速等 • 优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。 • 困难：传感器要求较高。

3.参数检测 • 对传感器的要求 • 能经受高压蒸汽灭菌； • 传感器及其二次仪表具有长期稳定性； • 最好能在过程中随时校正，灵敏度好； • 探头材料不易老化，使用寿命长； • 安装使用和维修方便； • 解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞问题； • 价格合理，便于推广。

3.参数检测 • 参数检测方法 • 温度测量感温元件：热电偶（温度信号→电信号）二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成被测介质的温度

3.参数检测 • 参数检测方法 • 搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速：磁感应式，光感应式，测速电机；搅拌功率：功率表，测定力矩求功率法。

3.参数检测 • 参数检测方法 • 空气流量测定体积流量型：会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响； ①同心孔板压差式流量计； ②转子流量计。质量流量型：根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）设计的流量计。

3. 参数检测 • 参数检测方法 • 罐压测量压力表压力传感器

3.参数检测 • 参数检测方法 • 发酵液粘度测定毛细管粘度计回转式粘度计涡轮旋转粘度计

3.参数检测 • 参数检测方法 • pH测量复合pH电极 pH测量仪器

复膜氧电极示意图 （a）极谱型（b）原电池型 3.参数检测 • 参数检测方法 • 溶解氧的测量化学法极谱法复膜氧电极法

3.参数检测 • 参数检测方法 • 溶解二氧化碳测量复膜式电极法渗透膜—碳酸氢钠法 • 发酵尾气的在线分析 CO2分析 O2分析

3.参数检测 • 参数检测方法 • 细胞浓度的测量化学法：如DNA、RNA分析等物理法：如重量分析、分光光度分析、浊度分析等 • 新技术：以电容法为测量原理的在线活细胞浓度测量传感器原位活细胞在线检测仪

二、代谢调控在发酵过程控制中的应用1.初级代谢物的生产调节二、代谢调控在发酵过程控制中的应用1.初级代谢物的生产调节初级代谢物：指一类低分子量的终点产物及这些终点产物的生物合成途径中的中间体。调节方法： (1) 避开固有的反馈调节 (2)细胞通透性的变更

（1）避开固有的反馈调节 • 反馈调节包括 ①反馈抑制：某一生物合成途径的最终代谢物抑制该途径的第一或第二个酶的活性。 ②反馈阻遏：抑制酶的形成，是由途径终点产物或其衍生物施行的。

（1）避开固有的反馈调节 • 方法 • 限制菌在胞内积累终点产物的能力以解除负反馈调节作用 • 从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统，筛选有抗反馈作用的基因突变型（对反馈作用不敏感）。 • 具体应用 • 积累中间产物的能力 • 积累终点产物的能力 • 耐反馈作用的突变株的筛选：抗结构类似物突变株

抗结构类似物突变株的筛选机制 • 末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈作用，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变株仍能制造末端产物并长成菌落。 • 突变株耐结构类似物的原因： ①酶的结构起了变化（指耐反馈抑制的突变株） ②酶的合成系统起了变化（指耐反馈阻遏的突变株）

（2）细胞通透性的变更 • 细菌细胞膜通透性的增加是谷氨酸过量生产的原因之一。 • 能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征： ①α-酮戊二酸脱氢酶缺失：表明这类细菌的TCA上的酶受阻，保证了碳引向谷氨酸的合成歧路。 ②对生物素的营养需求：表明这类细菌的生物素的生物合成受阻，导致细胞膜通透性的改变，使细胞可以分泌出谷氨酸。

2.次级代谢物的生产调节 (1) 次级代谢的特点及与初级代谢的关系 • 次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。 • 次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。 • 次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。

(2)调节方法 • 诱导作用 • 避开固有的负反馈 • 操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 • 耐负反馈调节的抗性突变株的筛选

操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 • 改变培养基成分来避免分解阻遏作用 e.g.链霉素发酵中限制磷酸盐的加量，避免其对参与生物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用 • 培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵产品的间接抑制作用

耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 • 筛选耐结构类似物的突变株 e.g.不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高产菌株 • 筛选耐药性菌株 e.g. 利用抗生素筛选耐药性菌株

(三)温度对发酵的影响及其控制 1.影响发酵温度的因素 2. 温度对微生物生长的影响 3. 温度对基质消耗的影响 4. 温度对产物合成的影响 5. 最适温度的选择与控制

(1)发酵热 • 发酵过程中所产生的热量，叫做发酵热。 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射

(2)生物热 • 来源：微生物对营养物质的分解所释放的能量。 • 影响因素： • 菌株 • 培养基成分 • 发酵时期：对数生长期最大 • 生物热与其它参数的关系 ①呼吸强度QO2 ②糖利用速率当产生的生物热达到高峰时，菌的呼吸强度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗来衡量生物热。

（3）搅拌热：液体之间、液体和设备之间的摩擦（3）搅拌热：液体之间、液体和设备之间的摩擦（4）蒸发热：发酵过程中以蒸汽形式散发到发酵罐的液面，由排气管带走的热量。（5）辐射热：罐内外温差，使发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。

2. 温度对微生物生长的影响 • 当μ>>α时，α可忽略，微生物处于生长状态。μ、α皆与T有关，其关系均可用阿累尼乌斯公式描述： • ∵Eμ＜Eα ∴死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感

嗜冷、嗜中温、嗜热菌的典型生长与温度关系

2. 温度对微生物生长的影响(续) • 在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。 • 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同 • 处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。 • 对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。 • 处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。

3.温度对基质消耗的影响糖比消耗速率qs • Righelato假定： m－维持因子，即生长速率为零时的葡萄糖的消耗。m项与渗透压调节、代谢产物的生成、迁移性及除繁殖以外的其它生物转化等过程所需的能量有关。这些过程受温度的影响，所以m也和温度相关。 B－生长系数，即同一生长速率下的糖耗，B值越大，说明同样比生长速率下，用于纯粹生长的糖耗越大。 • 改变温度可以控制qs和μ

m T(K) （2）T对B、m和μ的影响 • qs一定： • 当T<Tm时，m↑，μ ↑, B↓ 底物转化效率高当T>Tm时， m ↓ ， μ ↓, B ↑ 底物转化效率低当T=Tm时，温度对B、m和不同qs下对μ值的影响

4. 温度对产物合成的影响 • 影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。 e.g. 青霉菌发酵生产青霉素青霉菌生长活化能E1=34kJ/mol 青霉素合成活化能E2=112kJ/mol ∴青霉素合成速率对温度较敏感

4. 温度对产物合成的影响 • 改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。 • 影响生物合成方向。 e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：T<30℃，产生金霉素；T达35 ℃，产生四环素；谷氨酸发酵中扩展短杆菌： 30℃培养后37 ℃发酵，积累过量乳酸。 • 温度对菌的调节机制关系密切。

4. 温度对产物合成的影响 • 影响酶系组成及酶的特性。 • 米曲霉制曲：温度控制在低温，有利于蛋白酶合成 • 凝结芽孢杆菌的α-淀粉酶热稳定性：55℃培养→90℃保持60min，剩留活性为88%~99%；35℃培养→经相同条件处理，剩余活性仅有6%~10%。

5. 最适温度的选择与控制 • 定义：最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的生成，它是一种相对概念，是在一定条件下测得的结果。 • 二阶段发酵 e.g.青霉素发酵：菌体生长期,30 ℃ 青霉素合成分泌期, 20 ℃

5. 最适温度的选择与控制 • 最适温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握 • 通气条件较差情况下，最适发酵温度可能比正常良好通气条件下低一些。 • 培养基成分和浓度的影响

5.最适温度的选择与控制 • 变温培养：在抗生素发酵过程中采用变温培养比用恒温培养所获得的产物有较大幅度的提高。 e.g. 四环素发酵：0~30h稍高温度→30~150h稍低温度 →150h后升温发酵青霉素发酵：30℃, 5h→25 ℃, 35h →20 ℃, 85h → 25 ℃, 40h；产量提高14.7％

（四）pH对发酵的影响及其控制 1.发酵对pH的影响 2. pH值对发酵过程的影响 3. 最适pH的选择 4. 发酵过程中pH的调节与控制

1.发酵对pH的影响1）发酵液中pH变化的基本原理1.发酵对pH的影响1）发酵液中pH变化的基本原理 • 微生物代谢对pH影响主要在两种情况下发生：①酸性或碱性代谢产物的生成或释放；②菌体对培养基中生理酸性或碱性物质的利用。 • 引起发酵液中pH下降的因素（1）C/N过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降；（2）消泡剂加得过多：脂肪酸增加；（3）生理酸性盐的利用；（4）酸性产物形成：如有机酸发酵。

1）发酵液中pH变化的基本原理（续） • 引起发酵液中pH上升的因素（1）C/N过低（N源过多），氨基氮（NH4＋）释放；（2）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多；（3）生理碱性盐的利用；（4）碱性产物形成。

2）发酵过程中pH的变化规律 • 生长阶段：pH相对于起始pH有上升或下降的趋势 • 生产阶段：pH趋于稳定，维持在最适于产物合成的范围 • 自溶阶段：pH又上升或下降

发酵液pH的改变对发酵的影响 1会导致微生物细胞原生质体膜的电荷改变，从而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌 2pH变化影响菌体代谢方向 3pH变化对代谢产物合成有影响

2. pH值对发酵过程的影响（1）pH对微生物生长的影响 • 每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围细菌: pH 6.3～7.5 ；霉菌和酵母菌：pH 3～6；放线菌：pH 7～8 • 控制一定的pH值，不仅保证微生物生长，而且防止杂菌感染 e.g.石油代腊酵母： pH3.5～5.0：生长良好且不易染菌 pH>5.0：酵母形态变小，发酵液变黑，且污染大量细菌 pH<3.0：酵母生长受抑制，细胞极不整齐，且出现自溶

（2）pH对产物合成的影响 • 产物合成阶段的最适pH值和微生物生长阶段的最适pH往往不一定相同，这不仅与菌种特性有关，还取决于产物的化学特性。 e.g. 丙酮丁醇菌：生长pH为5.5～7.0；合成pH为4.3～5.3 青霉素产生菌：生长pH为6.5～7.2，合成pH为6.2～6.8 链霉素产生菌：生长pH为6.3～6.9，合成pH为6.7～7.3

（2）pH对产物合成的影响 • pH影响代谢方向： pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 e.g. 黑曲霉发酵：pH2~3, 柠檬酸；pH接近中性，草酸酵母菌发酵：pH4.5~5.0，酒精；pH8.0，酒精、醋酸和甘油谷氨酸发酵：pH7.0~8.0，谷氨酸；pH5.0~5.8, 谷酰胺和N-乙酰谷酰胺

（2）pH对产物合成的影响（续） • pH对青霉素发酵的影响：在不同pH范围内加糖，青霉素产量和糖耗不一样。 pH范围糖耗残糖青霉素相对单位 pH6.0～6.3加糖10% 0.5% 较高 pH6.6～6.9加糖7% 0.2% 高 pH7.3～7.6 加糖7% >0.5% 低 pH6.8控制加糖<7% <0.2% 最高速率恒定(0.055%/h) *采用pH控制补糖速率的意义

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