1 / 16

G FP Green fluorescent Protein

G FP Green fluorescent Protein. История Структура и свойства Применение Получение рекомбинантного GFP. Сергей Крат, МБФ. История. Выделен вместе с другим светящимся белком экворином из медузы  Aequorea victoria  Осаму Симомурой ( Jap ) 1960. История.

addo
Download Presentation

G FP Green fluorescent Protein

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. GFPGreen fluorescent Protein История Структура и свойства Применение Получение рекомбинантного GFP Сергей Крат, МБФ

  2. История Выделен вместе с другим светящимся белком экворином из медузы Aequorea victoria Осаму Симомурой (Jap) 1960

  3. История • Дуглас Прэшер секвенировали клонировал генбелка (1992) • Мартин Чалфиэкспрессировал последовательность в Escherichia coli и Caenorhabditiselegans (Science, 1994) • Исследования Фредерика Тцуи (конформация) • Нобелевская премия по химии «за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка GFP» (Осаму Симомура, Мартин Чалфи, Роджер Тсьен, 2008)

  4. GFP

  5. GFP Флуорофор = Ser65+Tyr66+Gly67

  6. Свойства GFP • 238 ако; • 26,9 кДа; • Пик фл-ии на 498 нм • emission/excitation395/509 • ИЭТ [4,6–5,4] • гидрофобный

  7. Применение GFP • Маркер в клеточной и молекулярной биологии • Исследования в области вирусологии Green fluorescent protein (GFP) as a vital marker for pathogenic development of the dermatophyteTrichophytonmentagrophytes Gil Kaufman, Benjamin A. Horwitz, Ruthi Hadar, others An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. van Remmerden Y, Xu F, van Eldik M, others

  8. Применение GFP • Исследования в области генной терапии • Иммуногистохимия Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research. Wahlfors J, Loimas S, Pasanen T, Hakkarainen T. Детекция экспрессии маркеров (оценка способности дифференцироваться у трансплантированных клеток в спинном мозге крысы)

  9. Использование GFP как метки в молекулярной биологии

  10. FACSПроточная цитометрия • Иммунология • Онкология • Цитология • Гематология

  11. Получение рекомбинантного GFP

  12. Задачи • Провести трансформацию E.Coli с pQE30GFP 2. Выделить плазмидуpQE30GFP 3. Экспрессировать GFP в E.coli 4. Выделить и очистить рекомбинантный GFP 5. Идентифицировать GFP методом иммуноблоттинга (Western-blotting) 6. Отработать методику определения концентрации GFP с использованием флуориметра VersaFluor (Bio-Rad)

  13. Провести трансформацию E.Coli Подобрать методику трансформации e.coli, например: Кальциевая трансформация, электропорация методика Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук «Методы генетической. Молекулярное клонирование.» (стр.240, гл.8)

  14. Выделить и очистить экспрессированный GFP На данном этапе работы необходимо разрушить клетки и разделить растворимые элементы, от нерастворимых. Далее необходимо из полученного образца выделить GFP. Можно использовать классические методы биохимии (сорбция, молек.сито, ИЭО и пр) в сочетании с более современными методами. Выделить рекомбинантный белок можно с помощью метода металл-аффинной хроматографии (IMAC) Руководство к практикуму по генной инженерии Евроген

More Related