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Zellfraktionierung

Zellfraktionierung. Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae. Durchführung. Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien Ernten A ufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen Mitochondrien Mikrosomen Proteinbestimmung nach Lowry

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Zellfraktionierung

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Presentation Transcript

  1. Zellfraktionierung Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  2. Durchführung Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien • Ernten • Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch • Isolierung + Reinigung der Fraktionen • Mitochondrien • Mikrosomen • Proteinbestimmung nach Lowry • Markerenzymmessungen • NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen) • Succinatdehydrogenase (Mitochondrien) • Quantitative Bestimmung der Cytochromen

  3. Reagentien Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Puffer A (Dithiothreitol) • Di-Sulfidbrückenwerden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe) • Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit) • Damit der osmotische Druck stabil bleibt • Zymolyase • Enzym zum Abbau von Zellmembran • Phenylmethylsulfonylfluorid • Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen • Triton X-100 • Detergenz löst Membranlipide • Phenanzinmethosulfat • Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die Reaktion

  4. Aktivitätsmessung Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Messung durch • Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine Reaktion hervorruft • Immunologische Charakterisierung • Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese • Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell.

  5. Unterschiede der Nährmedien • Aerob • Citratzyklus + Oxidative Phosphorylierung • Mitochondrien • Bis zu 12 ATP / Lactat • Niedrigere Zellausbeute zu erwarten • Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen • Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt • Cytosol • 2 ATP / Glucose • Pasteur-Effekt • Crabtree-Effekt • Höhere Zellausbeute zu erwarten Lactat Glucose Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  6. Citratcyclus & Fermentation im Vergleich Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus

  7. Citratcyclus & Fermentation im Vergleich 2 Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b2

  8. Unterschiede im Zellaufbau • Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien-Bildung • Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand • 50 min. bei 30°C mit Zymolyase • Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung • Niedrigerer Anteil an ß-1,6-Glucan • 30 min. bei 30°C mit halber Zymolyase-Menge Lactat Glucose Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  9. Proteinbestimmung nach Lowry Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption)

  10. Markerenzymbestimmung Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Benötigte Werte: • Aktivität ([ΔE/min], entspricht der Steigung), in dem Bereich, in dem die Steigung maximal ist!- umrechnen in Minuten • Volumen der Organellenfraktionen • Proteinkonzentration in der jeweiligen Fraktion

  11. Markerenzyme- Aktivitätsberechnungen Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Spezifische Aktivität [(ΔE/min)/mg] • Gesamtaktivität der Fraktion [ΔE/min]

  12. Markerenzyme- Reinheitsbestimmung Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch • Ausbeute • Anreicherungsfaktor • Kreuzkontamination

  13. Quantitative Cytochrombestimmung Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch Mittels Lambert-beer‘schem Gesetz Wellenlängenpaar λBasis/λMax zur Bestimmung von ΔE

  14. Cytochrom- Berechnung Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch Bestimmung erfolgt über Differenzspektrum der α-Banden ΔE…Extinktionsunterschied zw. λmaxund λBasis

  15. Nicht vergessen! Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch Verdünnungen beachten Einheiten Taschenrechner Schummelzettel

  16. Danke für die Aufmerksamkeit Fragen? Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

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