细 胞 工 程

1. 细 胞 工 程 ——改造和培养 细胞、组织、器官、个体的工程 刘广发 厦门大学教授 教育部中小学教材审定委员会委员 liugfls@xmu.edu.cn

2. 主要内容（1） • 细胞工程的基础知识与基本技术； • 植物组织培养； • 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； • 单倍体植株培养与利用； • 原生质体制备与细胞融合； • 人工种子制备； • 植物脱病毒技术；

3. 主要内容（2） • 动物细胞与组织培养 • 动物细胞融合 • 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 • 动物细胞核移植与哺乳动物克隆 • 人类干细胞研究

4. 细胞工程的基础知识与基本技术 • 基础知识 1. 原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。 2. 真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。

5. 二.基本操作 • 无菌操作概念与技术 无菌室布局、卫生、消毒、超净台 ×

6. 基本操作 2.细胞培养 （植物）取样 灭菌 培养 传代 收获 （动物）除菌 取样 3. 细胞融合 原生质体 融合 筛选

7. 植物细胞工程 主要内容： • 植物组织培养； • 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； • 单倍体植株培养与利用； • 原生质体制备与细胞融合； • 人工种子制备； • 植物脱病毒技术；

8. 第一节 植物组织培养 在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。 全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。

9. 植物组织培养过程 愈伤组织 培养 离体的植物器官、组织、细胞 再分化 脱分化 芽 根 植株

10. 植物组培基本过程

11. 1.基本组分：mg/L 蔗糖 3% , KNO3 1900, NH4NO3 1650, CaCl2 440, MgSO4 370, KH2PO4 170, 2.微量无机物：Na2•EDTA 37.3, FeSO4 27.8, MnSO4 22.3, ZnSO4 8.6, H3BO3 6.2, KI 0.83, Na2MoO4 0.25, CoCl2 0.025, CuSO4 0.025 3.微量有机物：mg /L 肌醇 100， 腺嘌呤 5， 甘氨酸 2，烟酸 0.5, 吡咯醇 0.5，硫胺素 0.1，生物素 0.01， 细胞激动素(KT) 0.04～10 吲哚乙酸（IAA） 1～30 4. Agar 10 g /L 预备阶段（1） 配MS培养基

12. 植物组培培养基为什么常用蔗糖？ • 蔗糖是双糖，葡萄糖是单糖，相同质量分数的蔗糖和葡萄糖，蔗糖形成的渗透压仅为葡萄糖的一半，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞因高渗脱水而生长不良； • 蔗糖可以进入植物细胞，但植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。 • 植物胞内有蔗糖转化酶，可以吸收和利用蔗糖； • 蔗糖作为培养基的碳源可在一定程度上减轻微生物污染； • 蔗糖比葡萄糖便宜。

13. 生长素类激素 • 吲哚乙酸（IAA）,常用1～10mg/L; • 吲哚丁酸（IBA）,常用1～5 mg/L； • 2,4-D（ 2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-5～10-7 mol/L; • 萘乙酸（NAA），常用1.0 mg/L；

14. 细胞分裂素类激素 • 激动素（KT） • 6-苄氨基嘌呤（6-BA） • 玉米素

15. 6-苄氨基嘌呤（6-BA，属细胞激动素类）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸馏水稍加热使其溶解；6-苄氨基嘌呤（6-BA，属细胞激动素类）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸馏水稍加热使其溶解； • 萘乙酸（NAA，属生长素类）：先用少量95%乙醇和少量0.1mol/L的NaOH溶解；

16. 不同植物的最适pH值

17. 预备阶段（2） • 选择合适的外植体 • 外植体大小要适宜； • 外植体的部位影响其分化能力和器官分化的类型； • 外植体的年龄影响其分化率； • 同一植物不同部位的分化需不同的生长素/激动素比例； • 不同物种的相同部位外植体分化能力不一样；

18. 预备阶段（3） • 除菌 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 外植体 无菌滤纸吸干 切割 无菌外植体 若干块无菌外植体置培养基上

19. 常用消毒剂的使用和效果 消毒剂 使用浓度/% 清除 消毒时间/min 灭菌效果 次氯酸钠 2 容易 5~30 很好 次氯酸钙 9~10 容易 5~30 很好 漂白粉 饱和溶液 容易 5~30 很好 升汞 0.1~1 较难 2~10 最好 酒精 70~75 容易 0.2~2 好 过氧化氢 10~12 最容易 5~15 好 溴水 1~2 容易 2~10 很好 硝酸银 1 较难 5~30 好 抗生素 4~50 mg/L 中等 30~60 较好

20. 植物不同器官的消毒和处理 • 种子 纯酒精浸10 min，无菌水洗净，次氯酸钙（10％）浸20～30 min，无菌水洗3～5次，无菌滤纸吸干； • 果实 纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（2％）浸10 min，无菌水反复冲洗，剥除种子和内部组织； • 茎切段 自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（2％）浸15～20 min，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干； • 叶片 自来水洗净，纯酒精漂洗，升汞（0.1％）浸1min，或次氯酸钠（2％）浸15～20min，无菌水反复冲洗，无菌滤纸吸干；

21. 诱导去分化形成愈伤组织 • 添加较高浓度的生长素； • 固体培养； • 液体培养； • 光照培养； • 黑暗培养；

22. 不同植物形成愈伤组织所需的激素种类和比例不同不同植物形成愈伤组织所需的激素种类和比例不同 • 只需生长素类激素，如菊芋的块茎； • 只需细胞分裂素激素，如芜菁根； • 需上述两类激素，但有不同比例，多数植物； • 还需复杂的天然提取物（椰子乳）等；

23. 继代增殖阶段 • 移植扩增； • 分割继代；

24. 光照培养室

25. 生根长芽阶段 • 生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用； • 外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例的反应也不尽相同；

26. 生根长芽阶段

27. 移栽成活阶段 • 保湿是关键； • 避免强光直射； • 温度适宜； “炼苗”

28. 手指玫瑰

29. 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 • 本方法的历史、现状 • 1956年，Routier & Nickell首先提出把植物细胞当作工业合成天然产物的途径； • 1968年，Reinhard, Corduan & Volks经培养生产出“哈尔碱”（harmine); • 1972年，Furuya & Ishii经培养生产出“维斯纳精”（Visnagin); • 1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”； • 1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”，达到60mg/L； • 目前世界最大的细胞培养罐达20 t；

30. 红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物

31. 从植物中提取天然产物的生产方式受到了挑战 • 生态环境的破坏和人们对野生资源的盲目采集，造成许多野生植物处于濒危状态； • 生态环境的差异，不易引种和驯化植物； • 可耕地面积日益减少； • 自然环境因素导致植物产量和质量难以控制； • 化学合成方法工艺复杂，费用高，同时造成新的环境污染；

32. 从植物培养细胞中获得的各类物质 • 氨基酸，核酸，蛋白质，碳水化合物，脂类，维生素，有机酸，核苷酸； • 抗白血病药，抗肿瘤药，抗病毒药，抗微生物药，酶抑制剂，阿司匹林，奎宁； • 色素，香料，甜味剂，鸦片，杀虫剂，激素，强心苷，可卡因； • 橡胶；

33. 细胞培养和原植物的天然产物量的比较 产 量 物 种天然产物 细胞培养原 植 物 橘叶鸡眼藤蒽醌 900微克/克干重110微克/克干重 决 明 蒽醌 鲜重的0.334%种子干重的0.21% 长 春 花蛇根碱 干重的1.3%干重的0.26 % 三角叶薯蓣薯蓣皂苷 26mg/克干重20mg/克干块根 人 参人参皂角苷 鲜重的0.38%鲜重的0.3~3.3% 烟 草烟碱 干重的3.4%干重的2~5% 烟 草泛醌 0.5mg/克干重16mg/克干叶 大 红 罂 粟蒂巴因 130mg/克干重140mg/克干叶

34. 培养植物细胞制造疫苗 • 2006年2月，美国Dow  AgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗； • 将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗，以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。

35. 马铃薯乙肝疫苗人体试验初步成功 2005年2月美国州立亚利桑那大学生物学家Charles Arntzen及其同事培育出了一种无需冷藏、可以食用的乙肝疫苗马铃薯。33名志愿者中有19人在吃了马铃薯后体内产生了乙肝抗体。

36. 悬浮培养 1.成批培养（封闭式培养） 优点：易于操作； 次生代谢物含量高； 缺点：效率低； 2.半连续和连续培养

37. 固定化细胞培养 次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性； • 细胞固定化有利于组织化的形成； • 细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质和各种物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键； • 细胞固定化有利于对外环境参数进行调控； • 细胞固定化有利于回收次生代谢物；

38. 平床培养系统 优点：制作简单； 能生产较多次生代谢物； 缺点：占地面积大； 分化区比例较小； 02供应受限；

39. 包埋法固定细胞 将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又分为凝胶包埋法和微胶囊法。 ⑴凝胶包埋法固定化（gel immobilization)①β-角叉胶（β-carrageenan) ②琼脂糖（agarose) ③琼脂（agar) ④聚丙烯酰胺（polyacrylamide) ⑤壳聚糖（chitosan) ⑥白明胶（gelatin) 温度控制！

40. ⑵微胶囊法 微胶囊法是利用天然的或合成的高分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球囊，培养基成分和代谢产物等小分子物质可以通过，细胞不能通过，使囊内成为一个微小环境。

41. 立柱培养系统 1.细胞固定化 • 琼脂固定细胞

42. 褐藻酸钙固定细胞 无菌大量培养植物细胞 等量混合 注入尼龙网 配制4%褐藻酸钠，灭菌 氯化钙溶液（2%）浸浴 褐藻酸钙固定的细胞团

43. 立柱培养系统 • 优点：占地面积小 次生代谢物产量高 缺点：制作较复杂 O2供应受限

44. 立柱培养系统操作要素 • 取静止期细胞，并使细胞达到一定密度； • 控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2供应； • 某些种的细胞培养需光照； • 尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）；

45. 第三节 植物原生质体制备与融合 几个名词： • 原生质体（protoplast):去除全部细胞壁的细胞； • 亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生质的原生质体（有核或无核）； • 微原生质体（miniprotoplast):经细胞松弛素B处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体； • 原生质球（球状体，spheroplast):残存少量细胞壁的原生质体；

46. 植物原生质体研究的意义 • 有利于进行远缘杂交； • 有利于引入生物大分子、细胞器等； • 有利于进行细胞操作（核、叶绿体等）；

47. 植物原生质体的制备(1) • 机械法： 高渗处理 植物（外植体，愈伤组织，液培细胞） 质壁分离 机械切割 原生质体（亚原生质体） 缺点：难，少，分生组织不宜；

48. 植物原生质体的制备(2) • 酶解法 市售的纤维素酶一般都是复合酶，含： 纤维素酶C1； 纤维素酶Cx； 纤维二糖酶； 果胶酶； 磷脂酶； 核酸酶； 过氧化物酶；

49. 植物原生质体的制备(3) • 酶解前外植体需除菌： 外植体 肥皂水洗 清水洗 酒精 （75%，10s） 次氯酸钠（3%，15min） 无菌水洗3~4次 无菌滤纸吸干

50. 植物原生质体的制备(4) • 外植体酶解 除菌后叶片 撕去下表皮 切块放入反应液 不时轻摇 反应液转绿 25～30℃ 2～4 h