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天 津 大 学 硕 士 研 究 生 学 术 报 告

天 津 大 学 硕 士 研 究 生 学 术 报 告. 杨树 LRR-RLK 基因对其维管系统发育的影响. 报告人：张宇. 指导教师：王洁华. 时间： 2013 年 9 月 27 日. 目录. 1 、课题研究背景. 2 、课题研究意义. 3 、研究方法与技术路线. 4 、当前研究进展. 5 、未来实验规划. 1 、课题研究背景.

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  1. 天 津 大 学 硕 士 研 究 生 学 术 报 告 杨树LRR-RLK基因对其维管系统发育的影响 报告人：张宇 指导教师：王洁华 时间：2013年9月27日

  2. 目录 1、课题研究背景 2、课题研究意义 3、研究方法与技术路线 4、当前研究进展 5、未来实验规划

  3. 1、课题研究背景 富含亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase，LRR-RLKs)是一类由多个富含亮氨酸重复序列的胞外结构域、单次跨膜域和胞内激酶域组成的蛋白分子，是植物中已知的最大的一类跨膜类受体蛋白激酶，在植物生长发育、激素信号转导以及生物与非生物胁迫反应中具有重要的调控功能。此类蛋白胞外富亮氨酸的结构域通过与多种特异的信号分子结合，激活胞内激酶区的磷酸化活性，从而将胞外信号传递到胞内，连接动态的转录和激素调节网络，从而影响植物的生长和发育。

  4. 1、课题研究背景 LRR-RLK 胞外区的显著特点是含有串联排列的 LRRs 结构，植物特异性的 LRR 基序一般含有 23 - 25 个氨基酸残基，其保守核心包含 7 个氨基酸残基：XXLXLXX ( X 代表任意氨基酸残基)，在三级结构中，LRR 结构域形成 α / β 螺旋，并位于蛋白质空间结构的表面，参与蛋白质间的相互作用，这种作用机制是细胞分子识别过程的基础。 根据激酶区的氨基酸种类，可以将 LRR-RLK 分为 12 个亚家族，每个亚家族的膜外区都有特定的 LRRs 数量和位置，而且不同亚家族具有的特殊结构可能与结合配基相关。

  5. 1、课题研究背景 自从玉米中分离第一个 LRR-RLK 基因以来，许多 LRR-RLK 基因的功能通过突变体和互补试验得到证实。目前已知LRR-RLKs参与调节植物体内多种生理过程，其中包括微生物与植物的共生、植物病害防御、自交不亲和反应、芸台素信号传导、细胞生长调控以及顶端分生组织干细胞的形成等。

  6. 1、课题研究背景 配体( 病原菌、激素信号等) 通过结合 LRR-RLK 的 LRRs 结构域,使胞内的激酶域结构改变,发生自身磷酸化或转磷 酸 作 用，从 而 将 胞 外信号传 递 到 胞内,LRR-RLK 可能形成异源二聚体,以促进对配体的识别和下游信号的传递。 其中与激酶结合的蛋白磷酸酶 ( KAPP) 可能参与到 LRR-RLK 下游信号的传递过程中。

  7. 1、课题研究背景 • 在LRR-RLK调控植物的生长发育方面，拟南芥CLAVATA(CLV)信号途径的研究较为深入。 CLV 信号途径在维持顶端分生组织干细胞数量中起到重要作用，由 CLV1 、 CLV2 和 CLV3 共同参与。 • CLV1在茎端分生组织（SAM）的L3层表达，编码一个膜结合的富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶 (LRR-RLK)，该基因突变将导致茎顶端分生组织干细胞数量增多、茎尖增大和花数量增多。 • CLV2编码富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白(LRR-RLP) ，与CLV1不同的是，缺少胞内激酶域。CLV2通过二硫键与CLV1二聚化而稳定CLV1，CLV1–CLV2与其它蛋白共同组成受体复合物。 • CLV3 是在植物分生组织中研究最为清楚的一个调控植物发育的多肽激素，其终产物是一个含有12个氨基酸的多肽，由一个96个氨基酸的含有分泌肽的前体蛋白经过剪切加工而成。

  8. 1、课题研究背景 • 研究表明，在SAM中，CLV1蛋白与CLV2构成受体激酶复合物与CLV3多肽配体结合，抑制转录因子WUSCHEL (WUS)的表达，调控SAM中干细胞的分裂，从而调控茎顶端分生组织的数量。 • BAM1-3是类似于 CLV1 的受体激酶，BAM1和BAM2突变体能够增强CLV1的表型，说明 BAM1/2 也可能与 CLV1并行介导 CLV3 的信号转导。然而，需要指出的是，CLV2 以及 BAMs 的胞外结构是否能够与多肽 CLV3 特异性地结合还未被研究。

  9. 1、课题研究背景 • Deyoung等2006年发现了CLV1结构相关的BAM1 (barely any meristem 1)、 BAM2 和BAM3 类受体激酶。通过对这些受体的功能缺失突变分析，发现其突变体中芽和花器官的干细胞数量减少，芽分生组织体积变小，这表明他们的生理功能与CLV1相反。 • 进一步研究表明，与CLV1的表达及功能的高度特异性不同，BAM蛋白在植物中有着广泛的表达谱及多重的生理功能作用。例如在拟南芥bam1 bam2双突变体中，拟南芥发育延迟，生长寿命延长；叶脉减少，排列不规则；发器官呈现缺陷的表型，几乎没有繁殖能力。 • 在bam1 bam2 bam3三突变体中，拟南芥在早期生长发育时便停止生长 (缺少顶端分生组织)，随后通过不定芽的形成开始恢复生长；雄蕊、心皮数量减少，表明花分生组织体积减小。

  10. 1、课题研究背景 • 因此，这些现象表明：BAM1、BAM2、BAM3不仅调节叶片维管束发育过程中维持维管束的形态，控制叶片的形状、大小及对称性，还在拟南芥雄性配子体的发育，胚珠的特异性和功能等方面起着重要的调控作用。值得注意的是，BAM 受体和CLV1激酶在分生组织和器官发育的不同作用，可能主要来源于它们表达模式的不同。

  11. 1、课题研究背景 • 2006年，日本研究人员在百日草细胞培养体系中分离出导管分化抑制因子（tracheary element differentiation inhibitory factor, TDIF）。TDIF与CLV3同属CLV3/ESR-related (CLE)植物短肽激素，由十二个氨基酸组成，具有抑制细胞的木质化，促进细胞分裂的活性。 • 2008年，拟南芥CLE41/44和CLE42基因被证实编码具有TDIF活性的短肽，并且它们在与LRR-RLK类受体激酶 (putative TDIF receptor gene，TDR)结合后，可促进形成层细胞分裂，抑制其分化为木质部细胞。TDIF和TDR的发现首次证明了由LRR-RLK介导的短距离胞间信号转导在植物侧生分生组织-维管组织的细胞分化中也具有重要作用。

  12. 1、课题研究背景 • 2007年，美国一研究组在拟南芥中分离到TDR的等位基因PXY (phloem intercalated with xylem)。PXY突变体中的形成层细胞在分裂过程中丧失了方向性，维管束中的木质细胞和韧皮细胞数目减少、位置混乱，而未分化细胞数量却有所增加，由此说明PXY编码的LRR-RLK对于维持形成层细胞的极性分裂和正常分化活性是必需的。2010年，同一研究组在Development杂志发表文章，证明了PXY由原形成层干细胞表达，同位于相邻的韧皮部细胞CLE41短肽结合后决定了维管干细胞的分裂平面。 • TDR-TDIF和PXY-CLE41复合物的发现首次明确了LRR-RLKs介导的胞间通讯对于维管组织的形态建成具有至关重要的作用。同时，维管形成层干细胞在选择分化或分裂两种细胞命运时，是通过LRR-RLKs受体与多肽激素CLE配体之间的特异性结合实现的。

  13. 2、课题研究意义 • 随着拟南芥( Arabidopsis thaliana ) 全基因组测序的完成, 以及相关研究的不断深入, 人们对植物维管组织的建立与分化在分子水平上有了进一步的认识。但作为多年生木本植物，杨树中次生维管组织的结构与组成均与拟南芥有所差别（例如拟南芥木质部缺少射线细胞），在维管系统的发育调控机制上也比拟南芥更为复杂。因此，在拟南芥的研究基础上，分离和鉴定木本模式植物中与维管组织形成与分化相关的调控基因仍是必须的。 • 研究表明，同拟南芥一样，在杨树的次生生长过程中，那些对顶端分生组织的形态建成与干细胞增殖与分化具有关键调控作用的基因，往往也会在维管形成层表达，这种表达可能源自同一个基因，也可能源自旁系同源基因。

  14. 2、课题研究意义 • 注释木本植物次生维管组织形态建成及形成层分化相关的PtLRR-RLK基因，掌握其时空变化规律与表达调控机制，明确其信号转导的下游靶基因及转录调控因子。 • 对LRR-RLKs在植物细胞信号转导及植物发育生物学领域研究进行重要补充 • 为实现人为调控木本植物次生维管系统发育过程，实现木材材性改良，发展速生丰产用材林提供基础数据和理论支撑。 • 深入研究影响和决定林木植物次生生长的分子调控机制，对于增强森林生态系统碳汇功能和CO2固持能力，更好地发挥森林系统的生态服务功能具有重大意义。

  15. 3、研究方法与技术路线 杨树维管PtLRR-RLK基因 （BAM1、BAM2、PXYa、PXYｂ）的分离 反义链的合成 表达载体的构建 杨树717的转化 RT-PCR 阳性转化子的分子鉴定 维管组织与结构 Realtime-PCR 形态建成与极性 形态学观察 次生细胞壁组成

  16. 当前研究进展 • 已完成基因的克隆与载体的构建 • 已完成杨树的转化 • 已获得转基因阳性株系 • 已同批次扩繁阳性株系进行表型观察统计

  17. 首先在拟南芥中找到4个与次生维管组织形态建成及分化相关的关键AtLRR-RLK基因（BAM1、BAM2、BAM3、PXY），再以这些基因编码的蛋白序列为基础在木本模式植物毛果杨数据库中进行查找，得到一些相似性程度较高的候选基因；通过构建系统进化树，筛选出4个与拟南芥相关基因的同源基因，分别命名为PtBAM1、PtBAM2、PtPXYa、PtPXYb。

  18. 利用Gateway技术构建表达载体： 1号PtBAM1_RNAi 2号PtBAM2_RNAi 3号PtPXYa/b_RNA 4号PtBAM1/2+PtPXYa/b_RNAi 5号PtBAM1/2_RNAi • 通过根癌农杆菌C58（pMP90）介导的方法对Populus tremula×P.alba的叶柄或不含腋芽的茎段进行遗传转化，获得具有潮霉素（10mg/L）抗性的再生转化苗。

  19. 1、切茎段 2、侵染后共培养 3、诱导愈伤组织 4、剥离独立愈伤

  20. 5、诱导长芽 7、诱导生根 6、诱导伸长

  21. 对每一种RNAi转化苗，用特异性引物进行基因组PCR进行阳性鉴定。对每一种RNAi转化苗，用特异性引物进行基因组PCR进行阳性鉴定。

  22. 未来实验规划 以下项目有待下一步开展： • 表型统计与鉴定 • 组织形态鉴定 • 生理生化指标测定 • 目的基因表达水平的鉴定

  23. 谢谢各位老师！

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