TESIS DE GRADO Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida

1. “SILENCIAMIENTO DE POSIBLES GENES ANTIVIRALES EN Litopenaeus vannamei Y SU EFECTO EN LA SUSCEPTIBILIDAD AL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV)” TESIS DE GRADO Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida ESCUELA SUPERIOR DEL LITORAL FACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA Y CIENCIAS DEL MAR

2. La charla de hoy I. Introducción: • Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) • ARN de interferencia (ARNi) • Efectosde inyectar dsRNA en camarón L.vannamei II. Métodos • Resultados: • Bioinformática • Fenotipos encontrados • Conclusiones

3. Objetivos • Identificar, de entre 54 genes candidatos, genes potencialmente involucrados en la respuesta antiviral de L. vannamei usando la técnica de silenciamiento genético (RNAi, siglas en inglés) mediante la inyección de ARN bicatenario (dsRNA, siglas en inglés). • Determinar las posibles proteínas codificadas por cada uno de los genes evaluados mediante análisis bioinformático de la base de datos genéticos (NCBI, National Center forBiotechnologyInformation).

4. Introducción White Spot Syndrome Exportaciones Ecuatorianas de Camarón Anual. Fuente: Datos tomados del CNA (Cámara Nacional de Acuicultura). La industria camaronera representa una de las actividades comerciales de mayor importancia para la economía del Ecuador. El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ha causado en el país grandes mortalidades en cultivos de camarón L. vannamei ocasionandopérdidas económicas sustanciales.

5. Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) Virión Núcleo -capside Morfología de WSSV Fuente: Virus Taxonomy: EighthReport of the International CommitteeontheTaxonomyViruses Familia, Nimaviridae Género Whispovirus ADN circular de doble cadena y envoltura lipídica exterior a la nucleocápside 275nm de longitud y 85nm de diámetro

6. Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) Descripción de la Enfermedad Manchas Blancas Reacción + anticuerpo Tejidosano Tejidoinfectado (WSSV) Tejidohematopoyeticoteñido con Anticuerpos contra WSSV • Aparición de manchas blancas en la cara interna de la cutícula de los crustáceos • Manifestación de signos de estrés • Letargia • Coloración rojiza • Anorexia • Natación en superficie • Muerte en horas o en unos pocos días • Mortalidades altas en cultivo • Enfermedad es atenuada a temperaturas altas • Transmisión • Horizontal

7. ARN de Interferencia (ARNi) : mecanismo antiviral en camarón 21 a 23 nucleótidos ARN mensajero degradado Bloqueo de ciclo de vida viral

8. Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei • dsRNA • dsRNA Homólogo • Respuesta inmune innata • Silenciamiento (ARNi)

9. HIPOTESIS: Para genes importantes en la respuesta antiviral de L. vannamei, la inyección de un dsRNA homólogo a los genes candidatos resulta en una respuesta inmune deficiente en comparación con dsRNAs usados como controles en este estudio. Criterios para la selección de genes candidatos Expresión aumenta en respuesta a una inyección de dsRNA. Expresión aumenta en respuesta a infección con WSSV. Genes importantes para el sistema inmune del camarón

10. Genes candidatos ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección ADNcFluorescente dsRNA Microarray Cuantificación de niveles de expresión,identificación de genes con expresiónmásabundante en animalesinyectados con dsRNA ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección Salina (control) ADNcFluorescente 54 genes candidatos ARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección ADNcFluorescente WSSV Microarray Cuantificación de niveles de expresión, identificación de genes con expresiónmásabundante en animalesinfectados con WSSV Extracto SPF (control) ADNcFluorescente ARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección

11. Síntesis de ARN de doble cadena (dsRNA) ADN 3’ 5’ 3’ 5’ • ADN purificado kit • QIAquick (QIAGEN) • dsRNA sintetizado in vitro con • ARN polimerasas T3 y T7 • 400 ug dsRNA (260/280=1.9-2.1) • dsRNA inyectado 4 ug/ind. ARN polimerasa T7 5’ ARN polimerasa T3 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Transcripción Transcripción 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Hibridación de las dos cadenas 3’ 5’ ARN de doble cadena

12. Sistema de Bioensayo: Diseño Experimental Sistema de desafíos individuales CONTROLES TRATAMIENTOS CONTROL NEGATIVO (Sol. Salina) CONTROL RESP. ANTIVIRAL (dsRNA-Inespecífico) CONTROL POSITIVO (WSSV) CONTROL ESPECÍFICO (dsRNA-Sal) dsRNA-WSSV Tamaño de la muestra= 40 Animales ≈ 1 gr.

13. Estrategia de Análisis: Bioinformático BIOINFORMÁTICA Marine Genomics Busca el contig (porciones de un genoma completo) en L. vannamei. Busca todos los EST que poseen similitud con el contig. NucleotideBlast (NCBI) Ensambla todos los EST encontrados y forma un nuevo contig. CAP3 SequenceAssemblyProgram Traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos en todos los posibles ORF. DNA protein-translateExPASy Blastx(NCBI) Valor Expect (<10-6); Referencia del ORF correcto. Muestra el dominio funcional para determinar la posible proteína que codifica ProteinBlast (Blastp NCBI) InterProScanSequenceSearch Dominio Funcional

14. Estrategia de Análisis: Estadístico FENOTIPOS DE GENES Tabla de Contingencia Mortalidad de cada tratamiento ESENCIAL Si el valor de p ≤ 0.05 dsRNA especifico-sal vs Neg. Si el valor de p > 0.05 dsRNA esp-WSSV vs dsRNA inesp-WSSV I. sucp. + ANTI-VIRAL p > 0.05 p ≤ 0.05 SIN FENOTIPO Índice de susceptibilidad I. sucp. - PRO-VIRAL

15. Resultados

16. Resultados

17. Resultados

18. Discusión-Conclusiones Uno de los 54 genes estudiados presentó un fenotipo de potencial interés (posible gen pro-viral). El 41% de los genes evaluados fueron esenciales para la supervivencia del camarón, aún en ausencia de infección experimental Encontrar genes antivirales tiene aplicación en la selección de camarones más resistentes a enfermedades. Identificar genes antivirales tiene relevancia para comprender a nivel molecular los mecanismos antivirales en el camarón.

19. Discusión-Conclusiones El silenciamiento con dsRNA (ARNi) representa un método promisorio para la evaluación funcional de genes candidatos.

20. Recomendaciones • En base a los resultados, se recomienda realizar más bioensayos en busca de genes antivirales en L. vannamei realizando réplicas para cada tratamiento. • Confirmar los fenotipos identificados en este y en futuros trabajos mediante la cuantificación de los niveles de ARN de los genes bloqueados • Realizar análisis a nivel histológico de animales que presentaron alta mortalidad en ausencia de WSSV (fenotipo esencial).

21. Agradecimientos • FINANCIAMIENTO: MUSC-USA BIOGEMAR-EC • ESPOL: Ph.D. Javier Robalino (Director de Tesis) Ph.D. Marcelo Muñoz Ph.D. Washington Cardenas • BIOGEMAR: Ing. Walter Intriago Msc. Ricardo Cedeño • CENAIM: Lcda. Irma Bentancourt Ph.D. José Melena

22. Gracias =)