Presentado por: Dra. Irene A. Gómez Espinel

1. HLA como un ejemplo de pruebas diagnòsticas en biologìa molecular Presentado por: Dra. Irene A. Gómez Espinel UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA CLÍNICA 2006

2. El ADN y su duplicaciòn

3. Componentes del ADN: Azúcar Bases Grupo fosfato

4. Azùcares

5. Bases nitrogenadas

6. Complementariedad de las bases

7. Bases nitrogenadas

8. DUPLICACIÒN DEL ADN

9. APLICACIÓN

10. Tipificación • En el Laboratorio de Biología Molecular del departamento de patología clínica del HU. • A partir de ADN obtenido de sangre periférica. • La tipificación de los genes HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-DR).

11. Obtención de la muestra

12. EXTRACCIÓN DE ADN

13. ADN

14. Comprobación cualitativa de la presencia de ADN

15. Comprobación cualitativa de la presencia de ADN

16. Comprobación cuantitativa de la presencia y pureza del ADN FORMULA: Ng/µl de ADN = (D.O 260 nm)(Factor de dilución)(50) Factor de dilución = volumen total de la celda (1005)/ volumen de muestra (5 µl) = 201 50 = factor para ADN de doble cadena 35 = factor para ADN de cadena sencilla 40 = factor para ARN

17. Reacciòn en Cadena de la Polimerasa (PCR) Técnica de laboratorio simple y rápida de amplificación del ADN que hace posible obtener múltiples copias y la identificación de secuencias específicas de ADN por medio de ciclos repetitivos utilizando el termociclador 1983

18. Historia de la PCR • 1983 Kary Mullis Inventa la PCR • 1985 Primera publicación científica • 1986 Cetus corparation y Perkin Elmer inician desarrollo de reactivos e instrumentos para PCR • 1988 Se publica el uso de la Taq para PCR (Saiki et al) • 1990-1993 Batalla de las compañías por los derechos de fabricación de reactivos. • 1993 Kary Mullis recibe el premio Nobel en Química.

19. Componentes de la PCR • DNA molde concentración de 25-200 ng/ml. • Iniciadores. (oligonucleotidos, primers, Cebadores). • dNTP´S. (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) • DNA Polimerasa termoestable. (Taq, Tli, Pfu) • Reguladores (Mg+2) • Ciclos de temperatura (Termociclador)

20. Termocicladores

21. PCR: pasos y ciclos

22. Pasos de la PCR 1.- Desnaturalización del DNA (95 0C)

23. Pasos de la PCR 2.- Hibridación del Iniciador (50-70 0C)- Alineamiento

24. Pasos de la PCR 3.- Polimerización (72 0C)

25. Ciclos de la PCR

26. PCR

27. Termocicladores MJ Research Dyad PTC-100 Opticon Tetrad

28. Tipos de PCR • PCR • PCR-RFLP • PCR in situ • RTPCR • PCR en tiempo real • PCR POR GRUPOS ALÉLICOS

29. IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE LOS GENES HLA-A y HLA-B EN POBLACIÒN DEL NORESTE DE MÈXICO

30. Sistema HLA Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA: • Son moléculas que se encuentran en los leucocitos y en la superficie de casi todas las células de los tejidos de un individuo. • Reconocen lo propio y lo ajeno • Aseguran la inmunidad.

31. Sistema HLA • Transmitidas de padres a hijos • También denominado de Histocompatibilidad • Existen tres clases de antìgenos HLA I, II, III • Existen tres "lugares estratégicos": HLA-A, HLA-B y HLA-DR

33. Cromosoma No. 6

34. Sistema HLA • El tipo de antígeno presente en A, B y DR es lo que determina la posibilidad de aceptación del tejido de un donante por el organismo de un receptor. • Para que dos personas sean compatibles, los antígenos presentes en cada uno de los tres lugares deben ser idénticos. • Análisis del ADN en sangre.

35. Evoluciòn de los alelos

36. Alelos de HLA identificados al 2006

37. Genética • Los genes del Sistema HLA se heredan siempre en bloque. • Cada bloque se denomina haplotipo. • El padre aporta un haplotipo (=mitad del genotipo) y la madre otro, dando origen al genotipo, perfil genético propio o individualidad del nuevo ser.

38. Sistema HLA Padre Madre Haplotipo a Haplotipob Haplotipo c Haplotipo d Hijos Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3 Combinación 4 Genotipo a-c Genotipo a-d Genotipo b-c Genotipo b-d Genética

39. Genética a b  c bc ac ad bd d 25 % ac, 25% ad, 25% bc, 25% bd 25% de posibilidades de coincidir con un hermano

40. Gen de HLA

41. PCR

42. ELECTROFORÈSIS Es el movimiento de partículas eléctricamente cargadas, a través de un gas, líquido y en soportes sólidos o semisólidos (geles), como resultado de un campo eléctrico formado entre los electrodos sumergidos en el medio acuoso.

43. EXON 3 MPM EXON2 Corrimiento electroforético Carril de ejemplo Cátodo Apilado del gel Marco de plástico Corrimiento del gel Ánodo

44. Revelado de los geles • Pasos a seguir: 1.- Solución fijadora 10´ 2.- Colorante AgNO3 5´ 3.- Lavar de 2 a 3 veces con H2O. 4.- Solución reveladora. 5.- Solución fijadora

45. Estos se realizan observando el DNA teñido con bromuro de etidio en un gel de agarosa. Interpretación de resultados.

46. Interpretación de resultados.Con Nitrato de plata

47. Enfermedades asociadas a genes HLA • Espondilitis anquilosante HLA-B27 • Síndrome de Reiter HLA-B27 • Enfermedad celìaca y hepatitis crónica activa HLA-B8 • Diabetes tipo 1 HLA-DR3 y DR4. • Artritis reumatoide con HLA-DR4. • Esclerosis múltiple HLA-DR2.

48. VENTAJAS ESTUDIO DE ADN 1.    Se puede detectar una mayor información que con la serología 2.    Los resultados pueden guardarse indefinidamente 3.    Se pueden identificar todos los componentes del sistema HLA 4.    más fiable en cuanto a la identificación de cada individuo. 5.    Más exacto ya que se eliminan reacciones cruzadas 6.    Rapidez en los resultados.

49. Puntos críticos en la técnica de PCR • Riesgo de contaminación: • ADN de la muestra • Moléculas de ADN previamente amplificadas • Alto costo de los reactivos y equipo • Espacio físico específico

50. Secuenciación automática