干细胞技术

1. 干细胞技术 主讲人：任彩萍教授

2. 干细胞研究是继人类基因组大规模测序 之后最具活力、最有影响和最有应用前 景的生命科学领域，1999年干细胞研究 被美国《Science》杂志评为1999年度 世界十大科技成果之冠，2000年再度入 选，2002年干细胞研究又被《Science 》 杂志列入值得关注的六大科技领域。

3. 一.概论 • 1.1 干细胞研究里程碑事件 • 1.2 干细胞的定义 • 1.3 干细胞的分类 • 1.4 干细胞的特性 • 1.5 肿瘤干细胞

4. 1.1干细胞研究重要事件 1959年，美国首次报道了通过体外受精(IVF)的动物。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 1978年，第一个试管婴儿，Louise Brown 在英国诞生。 1981年，Evan, Kaufman 和Martin从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES细胞。他们建立了小鼠ES细胞体外培养条件。由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。将ES细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1997年，“多莉”羊的出现，标志着体细胞核移植技术的成熟。 1998年，James A. Thomson首次从人囊胚内细胞团（inner cell mass）中成功分离得到人胚胎干细胞，掀开了人类生命科学研究新的一页 2005年，Chad A. Cowan等利用 人胚胎干细胞和人成纤维细胞融合得到的四倍体细胞具有类似人胚胎干细胞的特性。 2006年，Shinya Yamanaka等通过外源表达Oct4,Sox2,Klf4及c-Myc四个转录因子，使小鼠成纤维细胞重编程为诱导多潜能干细胞（iPS cells）,次年利用相同的方法获得了人的诱导多潜能干细胞。iPS细胞拥有类似于胚胎干细胞的特性，却避开了胚胎干细胞研究的伦理问题，成为当今干细胞研究领域的热点。

5. 1.2 干细胞的定义 干细胞一词最早由Wilson在论述细胞生物学的文献 中首次使用，当时人们认为干细胞只是能够产生子代 细胞的一种较原始的细胞。目前大多数生物学家和医 学工作者认为，干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内 的一类具有自我更新和增殖分化能力的原始细胞。在 特定条件下，它可分化成不同功能的细胞，形成多种 组织和器官，以实现机体内部建构和自我康复能力。

6. 1.3干细胞的分类 1.依据细胞来源： 胚胎干细胞（ embryonic stem cell，ESC ）:是由植入前早 期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）或胚胎原始生殖细 胞（primofdial germ cell,PGC）分离得到并能在体外培养 的高度未分化细胞。ES细胞在体内外可分化成外、中、内三 个胚层的组织，具有全能性、无限扩增性和可操作性。 成体干细胞（adult stem cell,ASCs：是指存在于人和哺乳 动物组织中，具有自我更新和一定分化潜能的不成熟细胞， 其作用是更新生理性衰老死亡的细胞或组织受损时的代偿性 增生。AS细胞的发育等级较低，目前在成年动物包括骨髓、 脑、皮肤等多种组织器官中均有存在，如造血干细胞、神经 干细胞等。

7. 2.依据分化潜能： 全能干细胞（ totipotent stem cell,TSC ）：具有分化形成任何类型 细胞的能力，可以发育为完整个体。真正的全能细胞只有受精卵、卵裂 球细胞 多胚层多能干细胞（亦称亚全能干细胞， pluripotent stem cell ）： 具有分化为生殖细胞在内的成体3个胚层所有组织细胞类型成熟细胞的 潜能，具有很强的可塑性，但失去了发育为完整个体的能力。如ES细胞 及可诱导的多潜能细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）。

8. 单胚层多能干细胞（multipotent stem cell）：一类具有向多种类型 成熟细胞分化潜能的细胞，其分化潜能比上述多能干细胞小，主要向相 应胚层的成熟细胞分化，如间充质干细胞通常只能分化为成骨、肌肉、 软骨、脂肪及其他结缔组织。 单能干细胞（ unipotent stem cells）：也称专能、偏能干细胞，是在 成体组织、器官中的一类细胞。此类细胞只能向单一方向分化，产生一 种类型或密切相关的二种类型细胞，如上皮组织基底层中的干细胞、肌 肉中的成肌细胞，是发育等级最低的干细胞。

9. 1.4 干细胞的特性 干细胞两大特性： • 自我更新（self-renewal） 自我更新是指一个干细胞分裂为子代细胞时，至少其中一个子代细胞仍然保持与亲代细胞完全相同的未分化状态。有不对称分裂和对称分裂两种方式。 • 多分化潜能 不论是ES细胞还是成体干细胞都具有程度不同的分化潜能。例如ES细胞在失去维持其未分化状态的条件后（如饲养层，生长因子），迅速分化，最终产生多种细胞系，如肌肉细胞、血细胞、神经细胞或发育成“拟胚体”（embryoid body,EB）

10. 1.5 肿瘤干细胞 肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）是近年来生 物医学领域的一个新词汇，关于TSC的研究是当今生 物学和医学领域的一个研究热点。 肿瘤干细胞，亦称癌干细胞（cancer stem cell,CSC）、肿瘤起始或激发细胞（tumor initiating cell,TIC）,是指肿瘤中少数具有干细胞性 质的细胞，它们具有自我更新、多系分化和无限增殖 潜能，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大 的源泉，可能是肿瘤发生、转移、复发、耐药的根源。

11. 干细胞技术 • 人胚胎干细胞的分离、培养及分化 • 人骨髓干细胞的分离、培养及分化 • 肿瘤干细胞的分离、培养

12. 人胚胎干细胞的分离、培养及分化 由于涉及到伦理及技术限制，全世界范围内只有很 少数的实验室能够建立人胚胎细胞系。 • 人胚胎干细胞的分离方法主要有两种： • 免疫溶解分离法 20世纪70年代由Solter和Knowles建立，用于EC细胞系的衍化及早期胚胎发育研究。 • 机械分离法

13. 免疫分离法 实验材料： 1.5-6天的人胚泡 2.链霉蛋白酶，0.5%，溶于DMEM 3.抗人抗体，30-50% 4.豚鼠补体，DMEM1:1稀释 5.hES培养基 DMEM/F12 39ml Seurm Replacement 10ml Glutamax 0.5ml NEAA(非必需氨基酸) 0.5ml bFGF(终浓度4ng/ml) 100μl

14. 包含以下几个步骤： 1.用链霉蛋白酶溶解囊胚透明带外层的糖蛋白。 2.将裸露的囊胚与抗人全血清抗体孵育30min。 3.用hES培养基短暂地冲洗胚泡使抗人抗体失活。 4.将囊胚移至含培养基的豚鼠补体中孵育，直至囊胚滋养层发生明显的裂解 5.选择性地去除滋养层后，将ICM培养在失活的鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层上。 6.当克隆 达到0.-0.5mm大小时，用拉长的玻璃吸管将它们切割成2-10个小块并转移到新的失活MEF饲养层上，重复几次传达后，hES细胞增殖按其常规培养法进行培养。 注意：初建的hES细胞系的团块每一代都要冻存直到获得大量冻存成功的冻存管。前10-15代最少50%的细胞将被冻存直到细胞系被很好地建立。

15. 机械分离法 通过机械切割、用27G针头拨离部分滋养层的方法， 或者通过将无透明带的完整囊胚放置在失活的MEF上 的方法等机械操作的方法，都能够从培养的囊胚中直 接衍化生成 ES细胞系。部分去除或者完全保留滋养层 的胚胎都能贴附到饲养层细胞上进一步铺展，里面的 ICM继续长大，残留的滋养层由复层变为单层。当 ICM足够大时，挑选出来进一步扩增。

17. hES细胞的培养方法 hES细胞的常规培养主要有两种： • 饲养层细胞共培养法 饲养层细胞是经过灭活处理的支持细胞，它已经失去增殖能力，但在一定时间内仍维持其它正常的生命代谢活动，主要起支持相应细胞的生长及维持相应细胞的表型，如防止其分化，过早凋亡等。hES细胞常与灭活的MEF进行共培养。 • 无饲养层细胞培养法 用基质胶、层粘连蛋白和纤连蛋白等替代饲养层，可以在MEF条件培养基培养下，维持hES细胞的生长。

18. 饲养层共培养法 包括以下两个步骤： • MEF的制备 • hES细胞培养

19. MEF的制备 实验材料; 1.妊娠13-14天的昆明白鼠 2.0.05%胰蛋白酶 3.无菌手术器械 4.D-Hanks缓冲液 5.100×双抗溶液 6.MEF培养基 高糖DMEM 88ml FBS 10ml NEAA 1ml Glutamax 1ml 双抗 100μl

20. 一.原代培养 1.处死妊娠13-14天的母鼠； 2.固定、酒精洗其腹部，暴露腹腔； 3.确定子宫角位置，取出放置在盛有10ml D-Hanks的无菌盘中； 4.用镊子把子宫壁撕开，取出胚胎放到无菌盘中； 5.将胚胎与胎盘和胎膜分离，用D-Hanks洗三遍； 6.去除胚胎头和尾部； 7.将胚胎剪碎成1mm3大小； 8.加入胰蛋白酶消化15分钟； 9.加入培养基中和、收集细胞和组织块离心去除胰蛋白酶； 10.吸去上清液，用培养基重悬，转移到培养瓶中培养。待细胞生长汇合度达到80％-90％时，进行传代或直接用于制备MEF饲养层。

21. 二.传代培养 1.弃去MEF培养基，D-Hanks洗3遍细胞。 2.加入适量胰蛋白酶（覆盖细胞表面即可），37℃消化2-3min. 3.加入适量MEF培养基终止消化，用吸管将细胞吹成单细胞悬液。 4.将培养基悬液转移至15ml离心管中，1000g,离心5min。 5.吸取培养基上清，加入适量新鲜培养基重悬细胞沉淀成单细胞悬液，将单细胞悬液分入到3个新培养瓶中，每瓶 补加适量新鲜培基，置于培养箱中培养。

22. 三.MEF饲养层的制备 1.当MEF生长汇合度达到80％-90％时，更换成新鲜培养基。 2.加入丝裂霉素C，使其浓度达到5μg/ml,处理2.5-3h。 3.D-Hanks液洗3遍，消化、收集细胞，1000rmp，5min，离心2次，用MEF培养基重悬细胞。 4.以7.5×104/ml接种于明胶预处理的六孔板(2ml)上，过夜待细胞贴壁后即可使用。

24. hES细胞培养 1.hES细胞的复苏 a.迅速从液氮罐中取出hES 细胞一支，37℃水浴至剩余少量冰晶，取出。 b.将hES细胞转移至15ml离心管，缓慢滴入9ml人ES培养基，1000rpm,离心5min；去除上清。 c.加入2.5mlhES培基重悬细胞。 d.灭活过的MEF细胞，用dPBS漂洗3次。 e.将hES悬液加入到MEF上，于培养箱中 培养48h小 时后，dPBS漂洗一次， 更换新鲜培养基，此后每 天换液。

25. 2.hES细胞传代 一般7D左右，hES细胞克隆达到较大水平，同时MEF饲养层开始死亡、失效，需要进行传代或者冻存： a.弃旧培养基，dPBS漂洗1次。 b.加入1ml胶原酶（1mg/ml），置二氧化碳培养箱中消化6-10min，以克隆边缘卷起为宜。 c.吸掉胶原酶，用培养基洗涤一遍。 d.加入培养基，用吸管将hES细胞克隆轻轻刮下，轻轻吹打使细胞分散成较小团块。 e.200g,离心5min后去除上清，加入适量新鲜培养基重悬，按照1: 48传于新制备的MEF饲养层上。

26. 需要传代的情形：1.hES克隆过大 2.开始接触

27. 3.hES细胞的冻存 饲养层上的人ES细胞在传代3-4天后，增殖能力比较旺盛且细胞克隆适中，此时将其冻存效果较好。 a.弃旧培养基，dPBS漂洗1次。 b.加入1ml胶原酶（1mg/ml），置二氧化碳培养箱中消化6-10min，以克隆边缘卷起为宜。 c.吸掉胶原酶，用培养基洗涤一遍。 d.加入培养基，用细胞刮子将hES细胞克隆轻轻刮下，轻轻吹打使细胞分散成较小团块。 e.200g,离心5min后去除上清，加入适量新鲜培养基重悬hES细胞。 f.小心滴加相同体积的2×冻存液（60％ defined FBS+20％DMEM/F12+20％DMSO），边加边振荡。 g.按1ml/管，迅速将细胞冻存悬液加入到冻存管中。 h.将冻存管置于Freezing container中，于-80℃冰箱过夜，再转入液氮中保存。

28. hES细胞的无饲养层培养法 A.条件培养基（conditional medium，CM）制备 丝裂霉素C处理后的MEFs以2.12×105/ml的密度接种于明胶预处理的六孔板上进行培养。在使用之前，用dPBS漂洗2-3遍，然后加入hES细胞培养基，第二天收集培养液并加入bFGF，即可作为生长在细胞外基质（Matrigel）上的hES细胞的条件培养基。 B.Matrigel预处理 从-20℃取出Matrigel aliquot，用适量的DMEM/F12培养基将其稀释，加入六孔板中，放置4℃冰箱备用。用前吸去稀释液，即可利用CM培养人ES细胞，培养方法同饲养层培养法

29. hES细胞的分化 利用分化培养基进行hES悬浮 培养，经过几天后，hES细胞 可以形成由多种组织类型细胞 形成的团状小块，即拟胚体 （embryoid body,EB）。 分化培养基即未加bFGF的hES培养基。 在特定的条件下，hES还可以向不同的方向分化,分化成特定的组织 细胞类型。

30. hES细胞向神经细胞分化 Zeng等将hES细胞与PA6细胞进行共培养，3周后87%的hES克隆呈酪氨酸羟化酶（多巴胺神经元表面标志物）阳性表达，PA6诱导hES细胞分化成的神经元细胞可以分泌多巴胺及3,4-二羟苯乙酸。

31. Figure 1. Neural differentiation of hESCs induced by the stromal cell line PA6. (A–C): Phase-contrast photographs of hESCs during neural differentiation. (A):A colony with an outgrowth of elongated cells after 6 days of coculture with PA6 cells. (B): Neurite formation and typical bipolar cellular morphology at day 10. (C): By day 14, cells that migrated out of the colonies displayed bipolar or multipolar morphologies, with extensive development of fine neurites. (D–F): Immunostaining of hESC colonies after 12 days of culture on a layer of PA6 cells. (D): Nestin. (E): Neural cell adhesion molecule. (F): TuJ1. Antibody staining is in red (Nestin and TuJ1) or green (NCAM), whereas nuclear 4',6'-diamidino-2-phenylindole staining is in blue.

32. Figure 2. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. (A–C): Immunostaining of PA6-induced cells with a TH antibody after 18 days of coculture with PA6 cells. (A): A colony that contained TH-positive cells is shown. (B): A high percentage of the cells in the colonies was positive for TH. (C):Examples of individual cells that were positive for TH. (D, E):Immunostaining for the additional neuronal markers synapsin(D) and synaptophysin (E). (F): TH-positive cells (red) were negative for the noradrenergic marker DBH (green). (G): Double labeling with TH (green) and BrdU (red) antibodies after 24 hours of growth in the presence of BrdU. Numerous BrdU-positive cells were seen around the edges of the colony, but TH-positive cells were consistently BrdU negative, indicating that the TH-positive cells were postmitotic. Abbreviations: BrdU, bromodeoxyuridine; DBH, dopamine beta hydroxylase; TH, tyrosine hydroxylase.

33. hES向心肌细胞分化 Xu等用5-氮-2’去氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine)诱导hES细胞分化出表达a2肌浆蛋白重链、肌钙蛋白及心肌转录因子GATA-4等的心肌细胞，这些细胞可保持收缩性70多天，并且得到的心肌细胞约占细胞总数的70％。

34. Figure 1. Differentiation of cardiomyocytes from hES cells. A, Confluent cultures of undifferentiated hES cells (a) were dissociated and cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs) (b). Ebs were transferred to gelatin-coated plates after 4 days in suspension culture to allow further differentiation into a heterogeneous cells, including spontaneously contracting cardiomyocytes that were positive for cTnI (c). .B,Percentage of Ebs derived from H9.2 cells (passage 29 +26, cells were subcloned from H9 at passage 29 and maintained for additional 26 passages) containing contracting cells during differentiation. C, Real-time RT-PCR analysis of cardiacα-MHC during differentiation of H1 cells (passage 29) normalized to 18S RNA.

35. Figure 2. Marker analysis of hES cell–derived cardiomyocytes.A, H7 cells (passage 37), dissociated at differentiation day 29,cultured for an additional 3 days and assessed for tropomyosin immunoreactivity. H9 cells (passage 28) were dissociated at differentiation day 15, cultured for an additional 2 days and stained with sMHC, α-actinin,desmin,and cTnT as indicated.B,H9cells(passage24)at differentiation day 11 were partially dissociated, further cultured for 10 days and stained with antibodies against sMHC and CK-MB or cTnI and myoglobin. C, H9 cells (passage 23) at differentiation day 14 were partially dissociated, further cultured for 10 days andstained with antibodies against GATA-4 or MEF-2 and cTnI as indicated. E, Cells derived from H1 cells (passage 30) at differentiation day 22 were stained with antibodies against cTnI and DAPIwas used for staining nuclei for A, B, C, and E.

36. hES向肝细胞分化 Cai等发明了三阶段分化方法，利用无血清培养基分阶段加入ActivinA、FGF-4及BMP-2成功地将hES细胞分化成肝细胞。

37. Fig. 2. Initiation of hepatic differen tiation from definitive endoderm cells by FGF4 and BMP2. (A) The relative albumin gene expression of the day-8 differentiated cells with different growth factor treatments were determined by real-time RT-PCR. Albumin gene expression was normalized to β-actin.A,Activin A; F, FGF4; B, BMP2; Su, Su5402;Nog, noggin. (B) Morphology of the differentiated cells at day-3, day-4, and day-8, with the sequential addition of Activin A and FGF4/BMP2 (upper row),or the spontaneously differentiated of hESCs (lower row). (C) Ki67 expression of the induced differentiated cells. (D)Expression of Alb, AFP, CK8, and CK18 in the day-8 induced differentiated cells detected by immunofluorescence staining. (E) RT-PCR analysis of liver cell marker gene expression in the day-8 differentiated cells. The RNA from the induced differentiated cells without reverse transcription was used as negative control. GF+, day-8 differentiated cells induced with Activin A and FGF4/BMP2; GF - , day-8 spontaneous differentiated hESCs. (F) The expression of CK7, AFP and Alb in the day-8 induced differentiated cells. (G) The expression of CK19 and Alb in the day-8 induced differentiated cells.

38. hES细胞向造血干细胞分化 Maria H. Ledran等将hES细胞与小鼠造血干细胞壁龛基质细胞（AGM细胞）进行共培养，能有效地将hES细胞分化成造血干细胞，同时证明是TGF-β1和TGF-β3促进了hES细胞向造血干细胞的转化。

42. 人骨髓干细胞的分离、培养及分化 骨髓干细胞主要包含两类干细胞： • 造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC） 能够自我复制和分化产生所有血液形成组织的一 类细胞 • 间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC） 指那些暴露与不同的诱导剂就能够形成不同的间 充质组织（如骨、软骨、肌肉、脂肪等）的细胞。

43. 造血干细胞的分离 造血干细胞主要通过对造血干细胞表面标蛋 白CD34进行分离。 通常先利用密度梯度离心等方法去除带分离物中的 红细胞和成熟粒细胞等成分，获得单核细胞，从而使 CD34+得到初步富集；然后利用CD34分子特异的抗 体标记单核细胞，通过流式细胞仪分离、免疫吸附或 者免疫磁珠等方法将标记的CD34+细胞与未被标记的 CD34-细胞分离开来，即获得纯化的CD34+细胞，而 此类CD34+细胞中含有大量造血干细胞。

44. 单核细胞的分离 以脐带血为例： • 先将脐血在室温下2000rpm,离心10min， • 弃上清，取下层血入瓶中; • 用移液管取等量的红细胞裂解液加入瓶中，按1:1混匀，静置5min; • 再以3:1加入红细胞裂解液，静置5min; • 用移液管吸取裂解后的脐血分别注入各离心管中，2000转/分钟，离心10min。 • 离心完毕后，弃上，取沉淀; • 将各离心管中沉淀的细胞集中至一到两个离心管中; • 1500转/分钟，离心8分钟; • 离心完毕后，弃去上清，取沉淀; • 将沉淀的细胞悬浮于5mlPBS中; • 取一离心管，加入2.5ml Ficoll; • 将细胞悬液缓慢注入加有Filcon的离心管，使细胞悬液铺在Ficoll上，并有明显分层; • 2800rpm，离心25分钟; • 取中间白膜层，PBS清洗3次(1500rpm，8min)，得到单个核细胞。

45. CD34+细胞的分离 采用MINIMACS免疫词性吸附柱分离装置，用CD34+细胞选择试剂盒，按说明进行CD34+细胞的分离和纯化: • 每108个细胞重新悬浮于300μl含EDTA的PBS中，加入100μl FcR封闭剂以防止非特异性的或Fc-受体介导的CD34微珠错误吸附于非目标细胞; • 在细胞悬液中加入10OμlCD34微珠，充分混匀，在6-12℃的冰箱里孵育30min; • 小心洗涤细胞，并将细胞重新悬浮于lml含EDTA的PBS中; • 将分离柱置于MACS系统的分离器上，用500μlPBS清洗分离柱内壁; • 将细胞悬液加入分离柱中，用力压下柱上的活塞，使细胞悬液通过分离柱; • 分别用500μl的PBS清洗分离柱3次，冲下未被标记的CD34-细胞; • 将分离柱从分离器上移开，放在一个远离磁场的离心管上; • 吸取1mlPBS加入分离柱中，用力压下活塞，使柱中滞留的细胞流出，并继续用PBS清洗分离柱3次，收集的细胞即为CD34+细胞。

46. 造血干细胞的培养 在体外培养造血干细胞，需要添加多种种血细胞因子来抑制造血干细胞的分化，已有30多种促进或抑制造血干/ 祖细胞增殖和分化的造血细胞因子被克隆和鉴定，多种造血细胞因子的组合联合基础培养基（含血清或不含血清）都能达到扩增造血干细胞的目的。

47. 培养基： 含血清： IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)+20%FCS+ SCF （100ng/ml）+Flt3 （100ng/ml）+ TPO （100ng/ml）+ G-CSF（10 ng/ml） 无血清: X-VIVO10 + SCF （100ng/ml）+Flt3 （100ng/ml）+ TPO（100ng/ml）+ G-CSF（10 ng/ml） 培养条件：37 ℃，5%CO2 ,培养7天进行半量换液， 一共培养十天。

49. 间充质干细胞的分离 MSC的分离主要依靠其贴塑料壁生长，培养基和生长因子相关的特殊培养条件。骨髓是分离MSC的最好来源，等是从抽骨髓是一个损伤性操作，且随年龄的增加，骨髓来源的MSC的分化潜能也会下降。因此，脐带血成为了分离MSC的最佳来源。脐血间充质干细胞的分离与造血干细胞的分离方法相似，都是先利用密度梯度离心等方法分离出单核细胞，再利用选择培养基进行选择培养，到达分离、扩增MSC的目的。

50. MSC的选择培养基众多，下面为一种常见MSC的培养基组MSC的选择培养基众多，下面为一种常见MSC的培养基组 成： IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’smedium)+20%FBS+ bFGF（10ng/ml)+2mML-glutamine+100Upenicillin+1000 U streptomycin。