Cardosina A

1. Estrutura terciária Cardosina A

2. Precursor Intermediário Cardosina A madura Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão assinalados com setas. Pro 31 KDa PSI 15 KDa RGTVRDSGSA HAIGANGVMNQQ EHLSTSSEE

3. Estrutura secundária Cardosina A Cadeia de 31 KDa Cadeia de 15 KDa

4. Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 1 Passo. Extracção Acídica Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5 1a. Centrifugação 1b. Filtração

5. MBarros Biologia Celular Cromatografia Separação baseada em propriedades dos compostos Exclusão Molecular Solvente Massa Molecular Detector UV Direcção do fluxo Propriedades Especiais Proteínas fraccionadas

6. Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 2 Passo. Cromatografia de Exclusão Molecular Coluna: Superdex G75 Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 A0+A+B

7. Gradiente linear de sal Força iónica MBarros Biologia Celular Cromatografia Cromatografia de Troca Iónica Separação baseada em propriedades dos compostos Bombas A e B Carga Aplicação da amostra Detector UV Propriedades Especiais Mistura de proteínas Mistura de proteínas Coluna de DEAE Tampão A Tampão B Proteínas carregadas + são eluídas primeiro + Resina Proteína + Proteína - + - + -

8. Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 3 Passo. Cromatografia de troca iónica Coluna: Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE) Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Gradiente crescente de 1M NaCl A B A0 +A

9. Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 5. Controlo de Pureza das Cardosinas Para o controlo de pureza das amostras de cardosinas recorre-se a electroforese vertical em gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes (SDS-PAGE). A A0 B +A 31 KDa 15 KDa 34 KDa 14 KDa Após Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)

10. Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da cromatografia anterior Coluna: Sephadex G25 Eluente: Água Mili_Q (água ultra pura) As amostras de cardosinas A0, A e B recolhidas na cromatografia de troca iónica são sujeitas a uma nova cromatografia de exclusão molecular numa coluna Desalting G25, com o objectivo de remover o sal. B +A

11. Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina B Coluna: Mono Q (trocador aniónico) Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Gradiente crescente de 1 M NaCl A amostra de cardosina B necessita de ser submetida a uma nova cromatografia de troca iónica numa coluna de maior resolução, a fim de remover a maior parte da cardosina A que contamina a amostra obtida na primeira troca iónica. B A

12. MBarros Biologia Celular • Resumo • A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou afinidade por determinados ligandos • Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma superfície sólida. • A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém um gel constituído por esferas. • A natureza das esferas determina o tipo de separação realizado. De acordo com: • - a massa, cromatografia de exclusão molecular • - a carga, cromatografia de troca iónica • - a afinidade, cromatografia de afinidade