实验 0Y 果蝇遗传标记分析 -PAPD

1. 实验0Y 果蝇遗传标记分析-PAPD 一、实验目的： 1. 掌握RAPD分析基本方法技术; 2. 了解分子标记的重要应用价值. 助教： 郑莹 二、主要内容： 基因DNA提取 PCR反应 电泳 电泳图谱的观察、分析

2. 三、实验原理: RAPD:建立在PCR基础上的一种分子标记。 模板高温变性→足够低的温度下（通常为36℃）与随机引物（一般10个bp）退火→ PCR →电泳 如果两个退火位点足够近（200-2000bp左右）、分别位于互补的DNA链上，可以通过PCR扩增出DNA片段。 引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

3. 若位点2处碱基发生改变，则

4. 四、实验材料-步骤 : 已经制备匀浆液 ,一半已经用于同工酶实验 1份（7种果蝇样品+1种其他）/小组 （1）D.Virilis ------------10只 （2）黑腹果蝇--P♀、P♂、 F1♀、F1♂、 F2♀、F2♂各40只 （3）其他材料 -- 0.2g （1）、（2）的P、（3）由教师提供，（2）F1、F2用自己存的材料。

5. 匀浆液200μL 匀浆液200μL 第一周做到此步 制备DNA粗提液： 每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其他材料0.2g） +400μL匀浆缓冲液匀浆 （冰浴操作） 用于同工酶实验 用于RAPD实验提取DNA 已完成 液体倒入1.5ml离心管 +22μL SDS、2μL的蛋白酶K 翻转混匀（动作要轻）→55℃水浴 >2h →存-20℃

6. 为省时老师代做此步 一周后的实验课及课余时间: 等V酚/氯仿/异戊醇（25﹕24﹕1）抽提 (慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大) +RNA酶至200μg/mL，37℃ 0.5~1h -20℃中取出的样品 上清（水相）至 冰浴10min 4℃ 12000rpm 离心5min 1.5ml新EP 等V氯仿/异戊醇（24﹕1），轻混匀 冰浴10min 4℃ 12000rpm ，5min 上清（水相）至 弃上清 1.5ml新EP 白色线团状物 4℃ 12000rpm ，5min 等V异丙醇，轻轻混匀

7. 弃上清 室温干燥（不要太干，否则DNA不易溶解） 4℃ 12000rpm ，5min 70%酒精洗涤 （2次） 0.6%Agarose电泳检测DNA质量 (免) +100μl TE 溶解 2. RAPD反应 1‘．在0.2ml PCR管中配制25μl反应体系 随机引物 1μl dNTP Mixture 2μl Taq酶 0.2μl 10×PCR buffer 2.5μl ddH2O up to 24μl 全班一人负责配齐（此配方×64，见下页） 每桌一人领取16份样品所需量 平均配给两组 各组等分8份 分别加8种样品的模板DNA 各 1μl

8. 反应体系64倍量（除模板外）： 随机引物 64μl dNTP Mixture 128μl Taq酶 12.8μl 10×PCR buffer 160μl ddH2O up to 1536μl （即1.536 mL）

9. 2’．在PCR热循环仪中进行如下反应： 94℃ 200s→ 94℃ 60s→36℃ 60s→72℃ 120s 40个循环 →72℃ (300s--600s) 3．电泳 2%琼脂糖凝胶电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。 尽量成批与老师约时间

10. 助教指导： 注意听 操作分工 技术问题 注意事项 实验作业（写在实验记录本上）： 1. 简述RAPD的实验原理、解决的问题； 2.将你的实验结果画（剪贴）在记录本上，标出样品名称、差异条带等；你的实验结论是什么？

11. 补充知识（课后阅读）： RAPD RFLP AFLP STR SNP

12. RAPD • 利用10个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增DNA片段，一般一个引物可扩增6-12条DNA片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。 • RAPD是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。

15. RFLP 是英文Restriction Fregrmeat Length Po1ymor— Phism的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。 RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。 所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。

19. 扩增片段多态性

20. “AFLP”续： 由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的DNA片段复制（扩增），而不能使另一品系的DNA片段复制（扩增）。 电泳分离：同一引物扩增 引物如： EcoRI和MseI相关引物 品系2 品系1

22. 短串联重复序列 STRs (short tendem repeats, mini-satellites ) STR广泛存在于人基因组，占约5%， 基本单位是1bp-8bp的串联重复， 重复次数 n=15-60，已知8000多个， 主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以(CA)n ， (GT)n 为多见。 1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。

23. 可变数目串联重复序列 VNTRs (variable number tandem repeats) 每个 VNTR 都含有10-15 bp核心序列， VNTR与STR比较类似，但是重复顺序更长； 多态性及分布方面不如STR，因而VNTR作 为遗传标记只是一种过渡，目前已较少使用， 但是，VNTR曾经对STR的基因定位运用起到 推动作用。

24. 单核苷酸多态性 （single nucleotid polymorphism，SNP） 定义：不同个体间，基因组DNA某部位的 单核苷酸的变异。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性 标记（single nucleotid polymorphism SNP） 制备第三代遗传连锁图的遗传标记。 可通过杂交、序列分析、电泳等检测。

25. Frequency of SNP in Human Genome 1，The most abundant DNA marker present in the human genome， about 90% of sequences variants in human are SNP. There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 2，A few hundred thousand are currently identified, but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated. 3, SNPs in coding regions of genes have been termed cSNPs, about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene.

26. The Functional Effects of cSNPs 1, Neutral alteration: a base substitution with no effect on the amino acid residue encoded. 2, Conservative change: a base substitution that results in an altered amino acid, but has minimal effect on protein structure or function. 3, Non-conservative alteration: leading to a change in the encoded amino acid residue that has dramatic effects on protein structure or function.

27. Major changes in protein structure can result from subtle variation in the genetic sequence encoding it. These changes can completely block the function of the protein in vivo and can also affect the development of high-throughput(高通亮) assays for screening therapeutic compounds.