水稻花粉发育过程及其分期

1. 水稻花粉发育过程及其分期 姓名：成勤勤 导师：王忠教授 2004.12

2. 丁颖等曾将水稻的生殖生长阶段即幼穗的发育过过程划分成8个时期,给育种应用和理论研究带来了很大的方便,一直被广泛采用。幼穗的发育主要是雌、雄生殖系统即胚囊和花粉的发育。其中对于胚囊的发育,刘向东等已作了系统的研究,并进行了分期。而对于花粉的发育过程,前人也有一些报道,但已有的报道往往是不同学者出于不同的实验目的,着重对小孢子发育的某一方面或某些阶段进行的研究,缺乏系统性。并且,在用词和术语上不统一,造成了一些混乱,如对于同一个时期,出现了单核晚期、单核靠边期、单核大液泡期等不同用法,这样就不便于资料的分析和比较。出于此原因，我们就水稻花粉的发育过程作进一步的研究。 研究在对固定的材料进行半薄切片观察的同时,又对新鲜的花药进行整体观察及游离细胞的观察,进一步验证花粉发育中的真实形态,以期能对水稻花粉发育过程作出准确的判断和分析,为相关的研究提供参考。

3. 1 .  材料与方法1.1 取样及树脂半薄切片的制作水稻种子浸种催芽后，按常法种植、管理。 从幼穗发育进入第 4期(雌雄蕊原基形成期)开始取样,直到开花为止。取穗中部的一次枝梗上的小穗(顶端的第一、二小穗除外),以小穗长度相差1mm进行分组固定。其中发育早期以刚形成小穗雏形,小穗长度不及1mm即行固定;发育后期参考小穗内、外稃形态及花丝伸长情况辅助判断。每组取小穗50个左右,切去小穗稃端及小穗梗,采用半薄树脂连续切片的方法。

5. 1.2　新鲜花药整体及游离细胞观察选择处于各生育期的主茎穗,放在铺有湿滤纸的平皿中,对穗中部的一次枝梗上的小穗(顶端第一、二小穗除外)依次进行观察。具体操作如下:在双目解剖镜下,剥出6个花药,其中3个迅速放入滴有2%蔗糖水溶液的载片上,盖片,进行整体花药观察;另外3个花药迅速放入滴有8%蔗糖水溶液的载片上,用解剖针横断花药,挤出花药药室内的细胞,盖片后观察游离细胞的形态。在Leica显微镜下进行观察及拍照。1.2　新鲜花药整体及游离细胞观察选择处于各生育期的主茎穗,放在铺有湿滤纸的平皿中,对穗中部的一次枝梗上的小穗(顶端第一、二小穗除外)依次进行观察。具体操作如下:在双目解剖镜下,剥出6个花药,其中3个迅速放入滴有2%蔗糖水溶液的载片上,盖片,进行整体花药观察;另外3个花药迅速放入滴有8%蔗糖水溶液的载片上,用解剖针横断花药,挤出花药药室内的细胞,盖片后观察游离细胞的形态。在Leica显微镜下进行观察及拍照。

6. 均采用树脂半薄连续切片显微技术，较之以往的石蜡切片，可以得到水稻花粉发育过程的更清晰的形象，包括某些现象的细节，有助于水稻胚胎发育过程中一些胚胎学现象的解释。本研究共观察了350个各时期的小穗材料,观察到从小孢子母细胞至成熟花粉的每一个时期。图版说明：Ta-绒毡层;Ml-中层;En-药室内壁;Ep-表皮;Ms-小孢子母细胞;Vn-营养核;Gc-生殖细胞;Sc-精细胞;V-液泡。均采用树脂半薄连续切片显微技术，较之以往的石蜡切片，可以得到水稻花粉发育过程的更清晰的形象，包括某些现象的细节，有助于水稻胚胎发育过程中一些胚胎学现象的解释。本研究共观察了350个各时期的小穗材料,观察到从小孢子母细胞至成熟花粉的每一个时期。图版说明：Ta-绒毡层;Ml-中层;En-药室内壁;Ep-表皮;Ms-小孢子母细胞;Vn-营养核;Gc-生殖细胞;Sc-精细胞;V-液泡。 1.3 实验说明

7. 2.水稻花粉发育的分期及特点通过对大量的新鲜花药进行整体观察及游离细胞观察,以及对固定的花药进行显微结构的观察和分析,初步将水稻花粉发育过程分为8个时期。2.水稻花粉发育的分期及特点通过对大量的新鲜花药进行整体观察及游离细胞观察,以及对固定的花药进行显微结构的观察和分析,初步将水稻花粉发育过程分为8个时期。

8. 2.1 小孢子母细胞形成期当小穗的内外稃刚刚合拢时,其内的花药呈四棱柱形。从横切面看,最外层为单层表皮细胞,表皮下方在四个角隅处分化出孢原细胞(图1-A)。随后孢原细胞进行平周分裂,形成初生壁细胞和初生造孢细胞。初生壁细胞进行两次平周分裂形成中层细胞和绒毡层细胞(图1-B)。同时,初生造孢细胞进行有丝分裂形成次生造孢细胞。次生造孢细胞经一次有丝分裂后发育为小孢子母细胞(图1-C)。至此,小孢子母细胞形成,药壁分化出四层,从外到内依次是表皮、药室内壁、中层和绒毡层(图1-C)。

9. 2.2小孢子母细胞减数分裂期 花药进一步发育,小孢子母细胞之间渐渐分离, 进入减数分裂阶段。本试验观察了从细线期到末期的减数分裂的各个时期。细线期小孢子母细胞之间稍微分开(图1-D)。粗线期小孢子母细胞核内出现明显可辨的染色线,同时细胞变成椭圆形状(图1-E)。到了中期 ,染色体排列于赤道板上(图1-F箭头)。其后,由新的细胞壁将其分隔成二分体(图1-G)。二分体分裂形成四分体细胞(图1-H、图3-A ),四分体的平面平行于花药纵轴,这样每个四分孢子都能与绒毡层直接接触。在同一个花药内,减数分裂过程并不是完全同步的,但一般是处于相邻的时期(图1-F)。整个减数分裂期间的小孢子母细胞、二分体及四分体均被胼胝质壁包围。在减数分裂过程中,四层药壁细胞发生液泡化,开始降解过程(图1-D)。进入减数分裂细线期,绒毡层细胞的内切向面及径向面的原生质体向细胞中央退缩,胞质浓缩(图1-D)。粗线期时,绒毡层胞质进一步浓缩,周边出现明显的“空腔”(图1-E箭)。直至二分体和四分体时,绒毡层的胞质仍呈浓缩状态,染色很深(图1-G,H)。

11. 2.3小孢子早期随着包围四分体的胼胝质壁的解体,四分孢子彼此分开,即进入小孢子早期。在新鲜的整体花药内或游离状态下,早期小孢子呈现圆球形或椭圆球形,小孢子“壁”隐约可见(图3-B)。实际上,在花药横切片上,此时的小孢子仅具有极薄的初生细胞壁,细胞质均匀,细胞核位于中央(图2-A)。2.3小孢子早期随着包围四分体的胼胝质壁的解体,四分孢子彼此分开,即进入小孢子早期。在新鲜的整体花药内或游离状态下,早期小孢子呈现圆球形或椭圆球形,小孢子“壁”隐约可见(图3-B)。实际上,在花药横切片上,此时的小孢子仅具有极薄的初生细胞壁,细胞质均匀,细胞核位于中央(图2-A)。

12. 2.4小孢子中期 当萌发孔的孔阜出现,细胞壁明显可辨时,即进入小孢子中期。在此期间,小孢子增大,壁显著加厚,液泡增多,并逐渐合并成较大的液泡,但尚未形成中央大液泡。细胞质相对稀少,并贴向细胞的周边(图2-B)。在固定的花药的横切片上,小孢子外形多不规则(图2-B),但从新鲜花药内释出的小孢子均呈规则的圆球形(图3-C,图3-C左上图)。这一时期,在绒毡层内切向面,已可见颗粒状的孢粉素体(图2-B箭头)。

13. 2.5小孢子晚期中央大液泡形成,小孢子核移至萌发孔对侧,核的体积增大,孢壁增厚(图2-C),并大体上恢复了圆球形(图3-D)。由于这一时期核的位置及中央大液泡的特点,在一些文献中,常称之为“单核靠边期”或“单核大液泡期”。在小孢子中期到晚期,除小孢子的核由细胞中央向萌发孔对侧的定向移动外,还观察到细胞质的“定向移动”现象:即小孢子核移至萌发孔对侧以后,在细胞核外侧聚集一股细胞质,向着萌发孔方向伸展,形成“细胞质桥”(图3-D左上图箭头)。小孢子发育的同时,药壁组织进一步降解。表皮及药室内壁细胞高度液泡化,中层细胞更加狭窄(图2-A,B,C)。在此期间,绒毡层的胞质由浓缩成的“空腔”状态(图2-A)逐渐变薄似带状(图2-B);当进入小孢子晚期,绒毡层细胞成为山丘状,染色变淡,但大多数细胞仍有细胞核轮廓及较丰富的细胞质(图2-C)。2.5小孢子晚期中央大液泡形成,小孢子核移至萌发孔对侧,核的体积增大,孢壁增厚(图2-C),并大体上恢复了圆球形(图3-D)。由于这一时期核的位置及中央大液泡的特点,在一些文献中,常称之为“单核靠边期”或“单核大液泡期”。在小孢子中期到晚期,除小孢子的核由细胞中央向萌发孔对侧的定向移动外,还观察到细胞质的“定向移动”现象:即小孢子核移至萌发孔对侧以后,在细胞核外侧聚集一股细胞质,向着萌发孔方向伸展,形成“细胞质桥”(图3-D左上图箭头)。小孢子发育的同时,药壁组织进一步降解。表皮及药室内壁细胞高度液泡化,中层细胞更加狭窄(图2-A,B,C)。在此期间,绒毡层的胞质由浓缩成的“空腔”状态(图2-A)逐渐变薄似带状(图2-B);当进入小孢子晚期,绒毡层细胞成为山丘状,染色变淡,但大多数细胞仍有细胞核轮廓及较丰富的细胞质(图2-C)。

15. 2.6二胞花粉早期小孢子核第一次有丝分裂,形成两个细胞,即较大的营养细胞和透镜状的生殖细胞。随后营养核向萌发孔方向移动,并在移动过程中体积增大(图3-E左上图)。这一时期花粉继续增大,外形仍不规则(图2-D)。但在自然状态下为圆球形(图3-E)。2.6二胞花粉早期小孢子核第一次有丝分裂,形成两个细胞,即较大的营养细胞和透镜状的生殖细胞。随后营养核向萌发孔方向移动,并在移动过程中体积增大(图3-E左上图)。这一时期花粉继续增大,外形仍不规则(图2-D)。但在自然状态下为圆球形(图3-E)。

16. 2.7二胞花粉晚期当花粉内开始出现淀粉粒直至生殖细胞分裂之前,为二胞花粉晚期。由于淀粉粒等物质首先在萌发孔附近积累,并在此处不断增加,液泡体积逐渐缩小,并被推至萌发孔的对侧。生殖细胞逐渐与花粉壁脱离,移至营养核的附近,此时的花粉壁仍有部分凹陷(图2-E),但在自然状态下为饱满的圆球形(图3-F)。绒毡层细胞的胞质降解加速,仅有胞质残留,其内表面分布着颗粒状孢粉素体。2.7二胞花粉晚期当花粉内开始出现淀粉粒直至生殖细胞分裂之前,为二胞花粉晚期。由于淀粉粒等物质首先在萌发孔附近积累,并在此处不断增加,液泡体积逐渐缩小,并被推至萌发孔的对侧。生殖细胞逐渐与花粉壁脱离,移至营养核的附近,此时的花粉壁仍有部分凹陷(图2-E),但在自然状态下为饱满的圆球形(图3-F)。绒毡层细胞的胞质降解加速,仅有胞质残留,其内表面分布着颗粒状孢粉素体。

17. 2.8 成熟花粉期当细胞内完全充满淀粉等贮藏物质时,花粉粒圆球形,生殖细胞进行第二次分裂,形成两个精细胞(图2-F)。此时由于花粉 内充满了淀粉等贮藏物,其内的三个核通 常不容易观察到。至此,水稻花粉的发育 过程完成。药壁各层细胞退化。表皮细 胞仅剩细胞轮廓,药室内壁加厚(图2-F箭),中层和绒毡层的原生质体降解消失,仅剩 下绒毡层膜紧贴在药室内壁上(图2-F箭头)。

18. 期号 时期 主要特征 起止点 小穗长度mm 1 小孢子母细胞形成期 小孢子母细胞呈多面体行，彼此相互紧贴，孢质浓厚，药壁四层细胞分化 孢原细胞出现至小孢子母细胞分裂前 1.0－2.9 2 小孢子母细胞减数分裂期 小孢子母细胞椭圆球形，经减数分裂各期最终形成四分体，绒毡层的胞质开始浓缩 小孢子母细胞减数分裂开始至形成四分体形成 3.0－4.9 3 小孢子早期 小孢子近球形，五液泡，尚未出现萌发孔核孢壁，绒毡层胞质浓缩状 四分孢子散开至萌发孔出现 5.0－5.4 4 小孢子中期 小孢子体积增大，液泡出现，核偏离中央，小孢子壁和萌发孔形成，绒毡层细胞成带状 萌发孔明显可见至中央大液泡形成前 5.5－6.9 5 小孢子晚期 小孢子体积明显增大，出现中央大液泡，胞质及核贴于孢壁内侧，壁加厚，绒毡层细胞山丘状 中央大液泡形成至小孢子核移到萌发孔对侧 7.0－7.9 6 二胞花粉早期 小孢子有丝分裂形成营养细胞和生殖细胞，营养细胞具中央大液泡，绒毡层仅剩残留物 小孢子进行有丝分裂至淀粉粒出现之前 8.0－8.4 7 二胞花粉晚期 小孢子体积增大，生殖细胞移向营养核，淀粉开始积累，尚有液泡 淀粉粒开始积累至液泡消失之前 8.5－9.0 8 成熟花粉期 淀粉粒等贮藏物充满整个花粉粒，生殖细胞分裂成2个精细胞，绒毡层消失，仅剩次生绒毡层壁 充满淀粉粒等内含物至3－细胞花粉粒形成 8.5－9.0 3.总结 综上所述,可将水稻花粉发育的主要分期特征列于表1。 表1 水稻花粉发育过程分期及各期主要特征

19. 谢谢！