Тема: Вплив гормонів на енергетичні процеси у мітохондріях. На прикладі катехоламінів.

1. Тема: Вплив гормонів на енергетичні процеси у мітохондріях. На прикладі катехоламінів. План 1. Теорія стресу та її розвиток 2. Порівняльна характеристика фізіологічних ефектів адреналіну та норадреналіну на тканини 3. Вплив катехоламінів на дихання та синтез АТФ у клітині 4. Роль іонів Са2+ у реалізації дії катехоламінів у клітині 5. Гормонально-субстратно-нуклеотидні системи

2. Три етапи розвитку стрес-реакції і їх взаємозв'язок із змінами нейро-гуморального балансу 1 – Симпато-адреналова система 2 – Гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникова система 3 – Рівень ацетилхоліну і гістаміну. Ганс Сельє

3. Синтез норадреналіну

4. Синтез катехоламінів

5. Адреналін vs. Норадреналін СН3

6. Вища температура тіла в районі нагромадження бурого жиру • Representative coronal slices of (a) high resolution 1Н MR image, (b) TmDOTMA- image obtained from the 1H methyl signal of TmDOTMA-, (c) absolute temperature image computed from frequency of the TmDOTMA- signal, (d) absolute temperature image fused with the anatomical image of an intact rat. The regions of brown adipose tissue (BAT), the heart (H), the upper abdomen (UA), the lower abdomen (LA) and the hindlimbs (HL) were at 40.4, 39.1, 36.5 and 34.4 °C, respectively. The average rectal temperature was at ~36.7 oC. (James et al. MRM 2009, 62: 550-556).

7. Основні етапи цАМФ-опосередкованої дії катехоламінів • Г1 і Г2 – гормони (катехоламіни), Р1 і Р2 – адренорецептори, Р’ – рецепторна субодиниця протеїнкінази, С – субстрати, що фосфорилюються каталітичною субодиницею (К) протеїнкінази

8. “Полярографічний” (хроноамперометричний) метод • Метаболічні стани за Чансом • Стан 2 ( V2, "спокою). За умов високого значення pО2 та відсутності АДФ існує рівновага між синтезом та гідролізом АТФ. Дихальні переносники переважно відновлені, а швидкість дихання МХ низька. • Стан 3 (V3, "активний"). За додавання АДФ дихання стимулюється і супроводжується фосфорилюванням доданої АДФ. Концентрація окислених форм дихальних переносників збільшується. • Стан 4 (V4, "контрольований“) . Кількість АДФ вичерпується. Відновленість дихальних переносників знову зростає, а швидкість дихання зменшується. Субстрат МХ Стан 2, V2 Зменшення О2 О2 макс. АДФ t АДФ О2 Стан 3, V3 O V3 Стан 4, V4 t нг-атом О / хв  мг білка МХ V4 V2 О2 мін. t

9. Потенціометричний метод • pН-метричний запис окисного фосфорилювання (I), кальцієвої ємності (II) та часу утримання Са2+ (III) у мітохондріях.

10. Реципрокний ефект адреналіну та ацетилхоліну на окисне фосфорилювання АДФ за окиснення бурштинової (SUC) та –кетоглутарової кислот (KGL) Окисне фосфорилювання A mVO2 B Мітохондрії печінки:Тонкі лінії – Контроль, товсті - Адреналін або Ацетилхолін 1, 2 - Адреналін 10 мг/100г, 15 хв. 1 - SUC 3 mM, 2 - KGL 1mM 3,4 - Ацетилхолін 50 мг/100г, 30 хв 3- KGL 1 mM, 4 - SUC 0.35 mM. A - Ацетилхолін 50 мг/100г, 30 хв 1 - KGL 1 mM, 2 - SUC 0.35 mM B - Aдреналін 10 мг/100 г, 15 хв 1- SUC 3 mM, 2 - KGL 1 mM

11. Розвиток оксалоацетатного (ОА) гальмування окиснення сукцинату за активації адреналіном (АД) фосфорилюючого дихання у мітохондріях печінки • Пунктир – прийнятий за 100% рівень фософрилюючого дихання МХ контрольних тварин. Незаштрихована частина діаграм – дихання за окиснення сукцинату, заштрихована – рівень ОА-гальмування (СКЦ + ізоцитрат). АДФ по 200 мкМ. • Час від ін’єкції: контроль 1,2 – 15 і 30 хв, контроль 3 – 3 год; АД – 1 -15 хв, 2 – 30 хв, 3 – 3 год. * - Р = 0,05. t АДФ Контроль 1,2 АД, 15 хв АД, 30 хв Контроль, 3 АД, 3 год

12. Cигнальна дія SUC і KGLin vivoна фосфорилююче окиснення SUC і KGL у мітохондріях схожа на ефекти адреналіну та ацетилхоліну, відповідно 1-3 - мітохондрії печінки, 4,5 – мітохондрії серця Тонкі лінії – Контроль, товсті – ін’єкція SUC (25 мг/кг, 30хв, і.р., 1-3) чи KGL (20 мг/кг, 30 хв, і.р., 4,5) Субстрати: SUC 0,5 mM (1, 5), KGL 1 mM (2, 4), KGL + малонат (3). Ін’єкція SUC Ін’єкція KGL Низькі сигнальні дози SUC per osстимулюють симпато-адреналову систему людини АХ KGLin vivoзбільшує рівень ацетилхоліну (А) та зменшує активність ацетилхолінестерази (В) та рівень адреналоподібних речовин 200 100 0 Діурез (мл за 2 год), адреналін і норадреналін (нмоль/хв) мкмоль АХ / хв х г маси мкмоль АХ / г маси АХЕ Підшлункова залоза. KGL – 200 мг/кг. Час реєстраціії після ін’єкції вказано на рисунку. АД НАД Діурез SUC (амонійна сіль) - 1,5 мг/кг. Параметри реєструвались 2 год після прийняття SUC.

13. “Дія” і “післядія” адреналіну • За дії адреналіну на функціонування мітохондрій виявляються дві фази: первинної активації і наступного гальмування. • Ця динаміка відповідає добре відомій двохфазній реакції живих систем на подразнення, яка має загальнофізіологічне значення (Введенский, 1951)

14. Фази процесів збудження за патогенного та фізіологічного впливу 1. Три фази відповіді організму за патологічного стресу. Зліва направо: спокій, підвищення активності за реакції тривоги, зниження активності за реакції резистенції і виснаження. 2 . Відповідні фази окислення сукцинату (СКЦ) у мітохондріях. Діаграми відображають дихання стмульоване АДФ. Світла частина – окислення СКЦ, заштрихована – інгібоване окислення СКЦ виявлене за допомогою активатора. 3 . Умовне об’єднання фаз відповіді за фізіологічного (світла стрілка) та патогенного (темна) впливу. Пунктир – початкова анаболічна фаза (м’яке пригальмовування зовнішніх функцій); суцільна лінія – посилення активності з переходом у більш глибоке інгібування зовнішніх реакцій. 1 АДФ 2 3

15. Глутамат-оксалоацетат трансаміназа (GOT) активується і адреналіном, і ацетилхоліном Кондрашова М.М. GOT дозволяє оминути повільну ділянку циклу Кребса, утворюючи «вкорочений цикл Кребса» (Coleman P. Chemical Carcinogenesis 2: 265, 1991), або «швидкий цикл» (Кондрашова МН, 1988), або «сукцинатний (бурштиновий) цикл» (Кондрашова МН, 2003). Його роль полягає у прискореному постачанні енергії через вибіркове утворення та окислення бурштинової кислоти (SUC). 1, 1*, 1** - трансамінази, 2 - піруваткарбоксилаза; 3, 3*, 3** - утворення та метаболічні перетворення фосфоенолпірувату; 4 – зворотній шлях циклу Кребса при гіпоксії; 5 – гліоксалатний цикл.

16. Трнасаміназні реакції відіграють важливу роль в енерготворчих процесах мітохондрій Гідроксиаміноацетат (HAA), інгібітор глутамат-оксалоацетат трансамінази (GOT), нівелює вплив адреналіну та ацетилхоліну на дихання мітохондрій 1 2 3 4 Тонкі лінії – Контроль, товсті – Адреналін або Ацетилхолін Адреналін: 1,2 – Гомогенат печінки, SUC 0.35 mM, 1- без HAA, 2 - HAA 1 mM. Ацетилхолін: 3,4 -Мітохондрії серця, KGL 1 mM, 3 - без HAA, 4 - HAA 1 mM. 31Р ЯМР спектри суперфузованих мітохондрій серця за окиснення різних субстратів. Концентрації (у mМ): піруват, 5; малат, 5; глутамат, 5; амінооксиацетат, 0,5. Позначено піки: МDP – метилендифосфонатний стандарт, Pi – неорганічний фосфат, ADP – АДФ (,), ATP – АТФ (,,).

17. CУБСТРАТНО-ГОРМОНАЛЬНА СИСТЕМА ВЗАЄМОРЕГУЛЯЦІЇ Взаємодія циклу Кребса із симпатичною та парасимпатичною нервовими системами SUC cтимулює діяльність гіпоталамусу [Дильман и др., 1976] і мозку. Недавно відкриті специфічні рецептори cаме для SUC та KGL[He et al., 2004] доповнюють наше уявлення про сигнальну дію саме цих двох субстратів циклу Кребса. SUC рецептор регулює артеріальний тиск у нирках та утворення реніну і ангіотензину. Ангіотензин активує синтез адреналіну [Dogan et al., 2004]. Ці дані пояснюють виявлену нами стимуляцію діурезу на фоні посиленого виведення катехоламінів після введення SUC in vivo [Maevsky et al., 1982].

18. CУБСТРАТНО-ГОРМОНАЛЬНА СИСТЕМА ВЗАЄМОРЕГУЛЯЦІЇ: Організація мітохондріального дихання у часових мікроінтервалах. Коливання циклу Кребса.

19. Органи, тканини та мітохондрії in vivo знаходяться під контролем нервових імпульсів. Реципрокні сигнали від симпатичної та парасимпатичної нервових систем змінюються у часових мікроінтервалах. Відповідно окислення cукцинату (SUC) і-кетоглутарату(KGL),активоване адреналіном (ADR) та ацетилхоліном (ACH) також може змінюватись у часі. Взаємодія цих субстратів та гормонів утворює два цикли, кожен з яких складається із як мінімум чотирьох інтервалів. 1- 4для адреналіну, I - IVдля ацетилхоліну. Адреналіновий цикл:1- зростання рівня гормону (ADR); 2 - активація сукцинатдегідрогенази (SDH), і глутамат-оксалоацетат трансамінази (GOT) та інгібування –кетоглутаратдегідрогенази (KGDH); 3 -активація моноамінооксидази(MAO) та зменшення рівня адреналіну; 4 – зменшення рівня SUC, зменшення KGL, що викликає зростання рівня ACH і започатковує Ацетилхоліновий цикл -I ; II - активація of KGDH, GOT та інгібування SDH; III – активація ацетилхолінестерази (ACHE) і зменшення рівня ACH; IV - зменшення окислення KGL , зростання окислення SUC, що викликає зростання рівня ADR і початок адреналінового циклу -1. Почергова активація окислення SUC і KGL може викликати коливання циклу Кребсаin vivo, яке нагадує скорочення серця регульоване ADR і ACH (“heart - beating" of mitochondria). Недавно з’явилось перше експериментальне підтвердження коливання рівня субстратів циклу(MacDonaldMJ et al. J.Biol.Chem.278: 51894, 2003).

20. Основні положення теорії • Адреналін вибірково стимулює окислення бурштинової кислоти (сукцинату) та інгібує окислення –кетоглутарату • Ацетилхолін вибірково стимулює окислення –кетоглутарату та інгібує окислення сукцинату • Глутамат-оксалоацетат трансаміназа активується і адреналіном, і ацетилхоліном • Адренергічна і холінергічна регуляція циклу Кребса здійснюється через три ферменти: сукцинатдегідрогеназу, –кетоглутаратдегідрогеназу і глутамат-оксалоацетат трнасаміназу • Сукцинат і –кетоглутарат in vivoстимулюють утворення адреналіну та ацетилхоліну, відповідно. Це призводить до прискорення окислення відповідних субстратів через активацію гормональних рецепторів. • Сигнальна дія мікромолярних доз сукцинату і –кетоглутарату in vivo може реалізуватись через рецептори недавно відкриті лише для цих двох субстратів циклу Кребса

21. Ключові публікації по теорії субстратно-гормональних систем: 1982 - 2005 рр. Maevsky & Guzar et al. Doesn't succinic acid mediate adrenaline stimulation in mitochondria? 3rd EBEC Reports, Lyon. 2: 537,1982. Шостаковская, Бабский. Влияние адреналина на транспорт кальция и окислительное фосфорилирование в митохондриях. Укр. біохім. журн. 56: 57, 1984. Кондрашова и др. Реципрокные саморегулирующиеся гормонально-субстратные системы: катехоламины – сукцинат; антагонисты катехоламинов - -кетоглутарат. В кн.: Физиология и биохимия трансмиттерных процессов/ 4-ая Всесоюзная конф. посвященная памяти акад. Г.Коштоянца, Москва, 1: 160, 1985 (перша згадка про теорію). Шостаковская и др. Активация ацетилхолином окисления –кетоглутарата в митохондриях печени. Укр. біохім. журн. 58: 54, 1986. Бабский и др. Действие и последействие адреналина на дыхание митохондрий. Физиол. журн. 31: 301, 1985. Kondrashova, Doliba. Polarographic observation of substrate-level phosphorylation and its stimulation by acetylcholine. FEBS Lett. 243:153, 1986. (перша публікація про теорію за кордоном). Kondrashova et al. Rapid cycle of substrate oxidation under activation of energy metabolism. 5th EBECReports, Aberysthwith 1:287, 1988. Kondrashova et al. Succinic acid as a physiological signal molecule. In: Signal Molecules and Behavior, Eds. W. Winlow et al. Manchester University Press, p. 294, 1991. Доліба та ін. Ефект –кетоглутарату і ацетилхоліну на енергетичний метаболізм у мітохондріях. Фізіол. журн. 39: 65, 1993. Гордій та ін. Адренергічна та холінергічна регуляція ефективності дихання секреторних клітин. Фізіол. журн. 40: 46, 1994. Стефанків та ін. Особливості дії норадреналіну на стимульоване ADP та іонами кальцію дихання мітохондрій печінки щура. Укр. біохім. журн.67: 22, 1995. Долиба и др. Реципрокное к сукцинату и катехоламинам влияние –кетоглутарата и ацетилхолина на окисление субстратов и нейро-гуморальный статус организма. В кн.: Янтарная (сукцинат) кислота в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Пущино, с.21, 1997. Шостаковська та ін. Ефект парантерального введення –кетоглутарату на резистентність до іонізуючої радіації та холінергічну систему щурів. Фізіол. журн. 45:119, 1999. Heet al. Citric acid cycle intermediates as logands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature 429: 188, 2004. (відкрито рецептори для сукцинату і –кетоглутарату) Кoндрашова и др. Субстратно-гормональная система регуляции физиологических состояний. В кн.: Горизонты биофизики. Пущино, 2003, с.147. MacDonald et al. Citrate oscillates in liver and pancreatic beta cell mitochondria and in INS-1 insulinoma cells.J Biol Chem. 278: 51894, 2003.(показано коливання рівня субстратів циклу Кребса) Dogan et al. Central angoitensin II increases biosynthesis of tyrosine hydroxylase in the rat adrenal medulla. Bioch. Bioph. Res. Comm.313: 623,2004. Jezovaet al. Angiotensin II AT1 and AT2 receptors contribute to maintain basal adrenomedullary norepinephrine synthesis and tyrosine hydroxylase transcription. Endocrinology144: 2092, 2005. Kondrashova M. et al. The interaction of Krebs cycle with sympathetic and parasympathetic nervous system. Substrate - hormonal system // Intern. Conf. on Mitochondria, 40 Years of Bari Meetings (Italy), p.74, 2005.

22. Історія проекту в особах          