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免疫印迹技术 ENA 测定

免疫印迹技术 ENA 测定. 自身抗体的检测方法. 免疫荧光法 (Immunfluorescence Assay, IFA) 酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA) 免疫印迹法 (Western-blot, WB) 放射免疫法 (Radioimmunoassay,RIA) 对流免疫电泳及免疫双扩散法. 间接免疫荧光法( IFT). ELISA: ENA 谱. 条带印迹法 : ENA 谱. 条带印迹法 : ENA 谱. 免疫印迹法. SDS-PAGE 电泳. 转移电泳. 酶免疫检测.

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免疫印迹技术 ENA 测定

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Presentation Transcript

  1. 免疫印迹技术ENA测定

  2. 自身抗体的检测方法 • 免疫荧光法 (Immunfluorescence Assay, IFA) • 酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA) • 免疫印迹法 (Western-blot, WB) • 放射免疫法 (Radioimmunoassay,RIA) • 对流免疫电泳及免疫双扩散法

  3. 间接免疫荧光法(IFT)

  4. ELISA: ENA谱

  5. 条带印迹法: ENA谱

  6. 条带印迹法: ENA谱

  7. 免疫印迹法 SDS-PAGE电泳 转移电泳 酶免疫检测

  8. 免疫斑点法（Immunospot） • 纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包被于硝酸纤维膜上，待测血清标本与之反应，如存在相应抗体，则会结合上去，并进一步结合酶标记的二抗，经酶底物显色即可观察到相应的抗体。

  9. 试剂 • 样本稀释液:直接使用 • 工作洗涤液：试剂盒内浓缩洗涤液用蒸馏水作1:10稀释. • 酶标记二抗:直接使用 • 底物:直接使用

  10. 操作步骤 • 润膜：取出反应槽，每槽加入1.5ml样本稀释液，缓慢于室温孵育5分钟,将膜条充分润湿。 • 加样：然后在每个槽中加入待检血清或质控血清15μl，充分混匀，缓慢在室温摇床上孵育30分钟。 • 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤4次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟。

  11. 操作步骤 • 加酶：每槽加入样本稀释液1.5ml，酶标抗体150μl，混匀，缓慢在室温摇床上孵育30分钟。 • 洗涤：同前洗涤。 • 显色：每槽加入显色液1.5ml，室温反应10分钟。 • 终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进行结果判断。

  12. 影响因素 • 未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。 • 全部操作需放在摇床器上进行，否则检测敏感性会有所下降。 • 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果需仔细观察。 • 试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结果。 • 该方法不受胆红素（<0.4mg/ml），溶血（血红蛋白<5mg/ml），脂血（甘油三脂<20mg/ml）干扰。

  13. 试验准备 • 分为4组,每组取2个病人标本,1个阳性质控,在一个反应板上试验。 • 提供8份不同血清标本,每组2份。

  14. 各组需领取以下物资： • 待测标本2份 • 阳性质控1份 • 反应板和吸水纸 • 样本稀释液1瓶 • 已配制好的洗涤液1瓶 • 二抗1支 • 显色液1瓶

  15. 结果解释 • 首先观察第一条质控线应显色才可判读结果，若不显色则说明试剂失效或实验失败，需复查。 • 将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照，即可判断出阳性抗体.

  16. 抗可提取性核抗原（ENA）抗体 • 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%） • 抗nRNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） • 抗SSA抗体：PSS 60 -75%，其它CTD • 抗SSB抗体： PSS 10 -40%，其它CTD • 抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体 • 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体 • 抗rib抗体： SLE特异性抗体（10%-30%） • 抗RO52抗体:不报告临床

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