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SIDA • El SIDA o Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida es una enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Este virus destruye o daña las células del sistema inmune de la persona interfiriendo en la capacidad del cuerpo de luchar efectivamente contra los virus, bacterias y hongos que causa la enfermedad. La infección por VIH hace que la persona sea más susceptible a infecciones que normalmente el cuerpo humano puede resistir como la neumonía, la meningitis y cierto tipo de cáncer.
Normalmente, los glóbulos blancos y anticuerpos atacan y destruyen a cualquier organismo extraño que entra al cuerpo humano, esta respuesta es coordinada por linfocitos CD4. Desafortunadamente, el VIH ataca específicamente a los linfocitos CD4. Una vez adentro, el virus les inyecta su propio material genético y los utiliza para replicarse o hacer copias de sí mismo.Cuando las nuevas copias del virus salen de las células a la sangre, buscan a otras células para atacar. Mientras, las células de donde salieron mueren. El virus gana. El número de células CD4 disminuye progresivamente y la persona sufre de inmunodeficiencia, lo cual significa que la persona no puede defenderse de otros virus y bacterias que causan enfermedades.
Enzimoinmunoensayo para la detección in vitro especifica de anticuerpos contra el virus VIH-1 Y VIH-2 en suero o plasma. • Se utiliza como complemento en pacientes con repetidas pruebas positivas de ELISA
Métodos muy sensibles: falsos positivos • Western Blot: muy específico • La prueba utiliza tiras de nitrocelulosa a las cuales se les agrega mediante electroforesis proteínas antigénicas que se obtienen de VIH-1 inactivado mas un péptido sintético específico del VIH-2.
Las tiras se incuban individualmente con el suero o plasma diluido del paciente y un control. • En caso de existir anticuerpos para VIH, estos se uniran a las proteinas del VIH-1 y el peptido del VIH-2. • Se lavan las tiras para eliminar productos no ligados. • Para visualizar la existencia de complejos antigeno-anticuerpo se utiliza un anticuerpo de cabra anti IgG conjugado con fosfatasa alcalina y sustrato BCIP/NBT.
Procedimiento • Añada 2 ml de Tampón de lavado diluido a cada pocillo. • Coloque cada tira en su pocillo con el número hacia arriba (incluir tiras para los tres controles). • Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente en un plato basculante (12-16 ciclos/min). Extraiga el tampón por aspiración.
Añada 2 ml de Tampón Blotting de trabajo a cada pocillo. • Añada 20 microlitros de suero del paciente o de control en cada uno de los pocillos. • Cubra la bandeja e incube 1 hora a temperatura ambiente en la plataforma basculante. • Incline la bandeja para aspirar la mezcla de los pocillos. • Lave tres veces cada tira con 2 ml de Tampón de trabajo diluido dejando que se empapen durante 5 min en la plataforma durante los lavados.
Añadir 2 ml de solución del conjugado de trabajo a cada pocillo. • Cubra e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. • Aspire los conjugados de los pocillos. • Repetir el lavado anterior. • Añada 2 ml de solución sustrato a cada pocillo. Cubra e incube durante 15 min.
Aspire el sustrato y aclare las tiras 3 veces con agua de calidad reactivo para detener la reacción. • Dejar secar las tiras dentro de los pocillos o en toallas de papel. • Coloque las tiras en una hoja de trabajo, observe las bandas y califique los resultados.
POL: transcriptasa reversa • GAG: proteinabasica viral • ENV: precursor viral de membrana externa • Gp 120: ENV, se une a los CD4
La presencia o ausencia de anticuerpos frente al VIH se determina comparando cada tira con las tiras de control del ensayo. • Es improbable detectar el gp 41 sin la presencia de gp 160 ya que este es la forma polimerica del primero. Asi mismo la banda de gp 41 es una banda difusa por lo que si se encuentra una banda nítida no debe interpretarse como gp 41. • La banda p 55 sueles detectarse cuando hay una reactividad fuerte para p 24 y p17 (GAGs)
Las bandas POL p66, p51 y p31 se detectan simultaneamente; p51 es menos sensible que las otras. • La reactividad cruzada para el VIH-2 es variable, es tipica la reactividad con antigenos GAG y/o POL. En algunos casos tambien con gp 160, es rara con gp 41.
Elementos necesarios interpretacion resultados • Que la banda de control de suero sea visible, con un control negativo los resultados son no validos. • Identificacion del peso molecular de cada banda de la tira utilizando como guia las las tiras de control. • Según la OMS se considera positivo el Western Blot si se detectan 2 bandas de ENV con o sin GAG o POL
1. Control positivo • 2.Control negativo • A. Paciente negativo • B. Paciente negativo con presencia anticuerpos no especificos. • C. Paciente positivo.
