1 / 54

Tours le 23 oct 2008

Vecteurs synthét i ques : SyntheGeneTransfer et Még a nucléa s es Applications à la thérapie génique. Tours le 23 oct 2008. Gene Therapy.

aleron
Download Presentation

Tours le 23 oct 2008

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Vecteurs synthétiques : SyntheGeneTransfer et MéganucléasesApplications à la thérapie génique Tours le 23 oct 2008

  2. Gene Therapy La thérapie génique est une stratégie thérapeutique qui consiste à faire pénétrer des gènes dans les cellules ou les tissus d'un individu pour traiter une maladie. La thérapie génique vise à remplacer ou complémenter un allèle mutant défectif par un allèle fonctionnel ou à surexprimer une protéine dont l'activité aurait un impact thérapeutique.

  3. * Mutation insertionnelle * Activation d’oncogènes * Extinction du transgène * Extinction du transgène choix du locus, du tissu * Différentes Approaches pour la Thérapie Génique Addition = Insertion du Gène dans un autre locus Intégration aléatoire Complémentation Intégration ciblée 2. Remplacement = Correction du Gène sur son locus Intégration ciblée

  4. HR & TG HR et TG = échange d’informations génétiques entre une séquence endogène sur un chromosome et une séquence exogène d’ADN (plasmide). Qq 100 pb d’homologie entre la séquence cible et le locus Des extrémités d’ADN libres = ADN db coupure => stimulation du processus ADN db coupure = signal pour la machinerie HR TG Gene targetting

  5. Homologous Recombinaison Réparation de l’ADN : coupure d’ADN double brin (DSB) S Undamaged DNA(Allele S) DSB Created (spontaneous or induced, e.g. by ZFN ) Strand Invasion into Undamaged Homologous DNA(Allele A) In gene targeting exogenous DNA serves as homologous DNA donor. Repairing of original strands of DNA. Gaps filled by DNA polymerase and nicks sealed by DNA ligase. Conversion of White Allele(“S”) into Red Allele (“A”) in region of DSB A A

  6. Homologous Recombinaison

  7. transposition GcvR recombinaison GcvS 3’ Néo 3’ HSV-TK Homologous Recombinaison

  8. Homologous Recombinaison

  9. Réparation de l’ADN NHEJ Non Homologous End Joining Réparation avec petites erreurs Homologous Recombinaison Réparation sans erreurs van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 : 757-765

  10. Saccharomyces cerevisiae • Trypanosoma brucei • Phycomitrella patens • Chicken DT40 lymphoid cell line • Qq souches E. coli HR & TG 100 % efficacité Dans les autres cellules : HR est inefficace10-7 à 10-5 - Murine Embryonic Stem Cells 1/100 à 1/1000

  11. Développement d’alternatives 1 - Correction par de petits oligonucléotides : mutation ponctuelle TFO triplex forming oligonucleotides RDO RNA-DNA oligonucleotide Kolb Trends Biotechnol 2005 SFHD short fragment homologous replacement 2 - Sequence-specific endonucleases = MEGANUCLEASE Correction ou insertion

  12. MEGANUCLEASE story 1980 découverte de HO et I-SceI Endonucléases de levure Initie HR à un locus spécifique I-SceI codée par un intron mitochondrial Copie l’élément dans un seul locus : HOMING 18 pb 18 pb parfait pour créer une seulecoupure dans le génome (418) 46 pour les enzymes de restriction

  13. MEGANUCLEASE story Elles sont codées par des éléments génétiques mobiles comme les introns de classe I ou les intéines, qui promeuvent leur propre dissémination par leur activité d'endonucléase. Domaine de liaison à l’ADN = domaine de coupure

  14. MEGANUCLEASE story Méganucléase = endonucléase site >12pb Méganucléase naturelle = Homming endonuclease Méganucléase artificielle = Zing finger. Familles de protéines eucaryotes, bactéries et archébactéries, végétaux Pas chez les métazoaires animaux pluricellulaires

  15. 37GFP-IRES-CD8 327 Stop-Sce Site GFP Gene Targeting System 37GFP-IRES-CD8 CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8a-PGK-Neo

  16. Spontaneous Gene Targeting CMV/CBA-GFP-IRES-CD8a-PGK-Neo Rate= 7.1 x 10-7 (Approximately 1 per million)

  17. 37GFP-IRES-CD8 Stop-Sce Site DSB-Mediated Gene Targeting 37GFP-IRES-CD8 CMV-Sce CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8a-PGK-Neo Stop-Sce Site Cellules de mammifères

  18. CMV/CBA-GFP-IRES-CD8a-PGK-Neo Les méganucléases fonctionnent chez les mammifères Problèmes : Insertion aléatoire Réparation des jonctions efficace d’un seul côté Localisation DSB et correction (< 500pb) Pas de site I-SceI naturel chez les mammifères DSB-Induced Gene Targeting Optimized Rate of DSB Mediated Gene Targeting= 3-5 x 10-5 à-2 (3-5%)(or 30-50,000 per million)

  19. Méganucléase & CO + 100 candidats Mais le répertoire des séquences cibles ne rend pas compte de la complexité des génomes DAGLIDADG His-Cys box Engineering des protéines mais extrêmement complexe Manque informations structurales et de méthodes

  20. How to create that DSB?

  21. Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .) DNA cleaving ribozyme? Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP Modified homing endonuclease. Not the purpose

  22. Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP • Motifs les plus répandus dans les domaines de liaison à l’ADN (TFs) - 30 AA organisés en une structure  stabilisée par un ion Zn2+ Grand sillon de l’ADN - Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides

  23. - Les ZF sont assemblables entre eux pour former des protéines polydactiles avec de nouvelles spécificité de reconnaissance. Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP Les ZF Cys2His2: de nombreux avantages • Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides • Fonctionnement modulaire de la protéine

  24. Nous avons la spécificité comment créer la coupure? Les ZFPs peuvent être fusionnées à un domaine effecteur

  25. FokI nuclease domain (Fn) FokI nuclease domain (Fn) Création d’une Zinc Finger Nucleases = le domaine de coupure de FokI + domaine de reconnaissance de l’ADN de ZF Initially developed by labs of Srinivasan Chandrasegaran (Johns Hopkins) and Dana Carroll (Univ. Utah)

  26. SANGAMO

  27. SANGAMO

  28. “Sure, but how to create that gene specific DSB?”

  29. FokI nuclease domain (Fn) FokI nuclease domain (Fn) Zinc Fingers Seem to Bind DNA in a Modular Fashion

  30. Preuve de concept ZFN Full Site/Sce Site GFP* CD8 CMV/CBA IRES WRE Sce or ZFN Expression Plasmid tGFP Témoin le donneur GFP seul GFP Donor CD8 FP G CMV/CBA IRES WRE tGFP GFP CD8 CMV/CBA IRES WRE (G2/M) 3% of asynchronously cells Le donneur GFP + le plasmide ZFN

  31. Hah, reporter genes are fine, but show me an endogenous target.

  32. Mutations in IL2RG Gene that Cause SCID Stratégie ZFP Urnov et al. (2005) 24 pb; 4 ZFP de part et d’autre du hotspot Stratégie IL2R

  33. Experimental Design to Detect Targeting at Endogenous IL2RG Locus Transfect K562 cells with IL2RG ZFNs with repair substrate that contains BsrBI polymorphism. Isolate individual clones (no selection). Expand individual clones (no selection). Harvest genomic DNA from individual clones. Analyze genomic DNA for BsrBI polymorphism.

  34. Correction monoallèlique Correction biallèlique Single-step Homozygous Gene Targeting in Somatic Cells (K562) 20% Correction Urnov et al. (2005)

  35. Next • Essais dans d’autres types cellulaires • Essais pour d’autres gènes • Sécurité. • Existence de DSB à d’autres loci =>instabilité génomique? • Immunogénicité des ZFN • Toxicité • Méthode de délivrance • Moins de problèmes • Cellules autologues In vivo Ex vivo

  36. Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .) DNA cleaving ribozyme? Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP Modified homing endonuclease. Fin des années 90 Not the purpose

  37. Modified homing endonuclease. Spécifité et coupure

  38. His-Cys box DAGLIDADG dans la 1ere hélice de  • I-PpoI • dans le gros sillon Courbure de l’ADN cible • I-CreI, I-MsoI, PI-SceI • dans le gros sillon Les + compactes, les + connues Interaction directe de qq AA et Ac nuc Les plus intéressantes Modified homing endonuclease. Fin des années 90 Spécifité et coupure Boost après la cristallisation des premières protéines  

  39. AA cibles symétrie Engineering HE DAGLIDADG I-CreI Interface de contact protéine/ADN Smith et al NAR 2006

  40. Engineering HE DAGLIDADG   Modification de certains AA de I-CreI mais conserver  palindrome 64 cibles Smith et al NAR 2006

  41. Levure bleue X site cible potentiel Engineering HE DAGLIDADG Screening de nouvelles cibles ADN palindromiques Test de fonctionnalité en levure, coupure de lacZ-, HR, restauration lacZ+ Conclusion Folding OK Stabilité OK Coupure OK Mais 9 AA contactent Ac Nucl 209 variants Imposible à cribler

  42. Engineering HE DAGLIDADG Découverte d’un fonctionnement en 4 sous modules Cible= patchwork des mutants parentaux Analyse combinatoire en petits sous problèmes = même approche ZFP Essai ciblage du gène RAG1 Recombinaison VDJ Maturation des Ig SCID phenotype

  43. Engineering HE DAGLIDADG • HE redessinée pour couper une séquence naturelle • Efficacité (aussi efficace que I-SceI GT) • Toxicité (peu ou pas toxique) • Résultats : • loci artificiels • lignées immortalisées Et dans des cellules primaires et des gènes endogènes ?

  44. CELLECTIS

  45. 2007 http://www.oseo.fr/a_la_une/paroles_d_entrepreneurs/sur_lci/cellectis

  46. Perspectives Recombinaison et cycle de division (S/G2) Recombinaison et accesibilité de la chromatine Quels types de vecteurs? Toxicité due à la perte de spécificité * tolérence de dégénérescence dans le site cible => coupure cryptique = génotoxicité (ZFN+++) * HE ou ZFN fonctionnent sous la forme hétérodimère dans la cellule => formation d’homo et hétérodimère => homo => perte de spécificité solution dans la nature HE homodimere = un polypeptide Engineering ZFN et HE grande avancée pour des applications en thérapie génique… DEMAIN

  47. I want to stay as close to the edge as I can without going over. Out on the edge you can see all kinds of things you can’t see from the center. http://www.vonnegut.com/ -Kurt Vonnegut

  48. Réparation de l’ADN van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 : 757-765

  49. 2 voies de réparation Avec homologie Sans homologie 6 protéines Ku70/86, XRCCA, DNA ligase IV sont conservés de la levure à l’homme MRN sont conservés de la levure à l’homme Protéines ubiquitaires (MRN est partagé par les deux systèmes Lisby et al 2005 Biochimie) Lieber et al., 2004 DNA repair;

  50. Nucléase (5’-> 3’) Sérine/Thréonine kinase une fois fixé sur l’ADN, s’autophophoryle et P Artémis Famille polymérase X Nucléase reconnaît les jonctions ss et ds de l’ADN Phosphorylation d’Artémis par ATM et PKc Coupure Libération du site ATM active les protéines de contrôle du cycle cellulaire S et G2/M, indépendantes de la p53 PKc et Ku active l’apoptose via p53 L’hétérodimer Ku70/Ku86 très abondante--> dès l’apparition d’un DSB, Ku se fixe. Sur chaque extrémité Ligase L’intervention séquentielle des 3 types de protéines est variable La structure des extrémités reconnues est variable (5’ ou 3’ débordante, bout franc) La nature des réparations est variable Ma et al., 2005 Cell Cycle; Lieber et al., 2004 DNA repair;

More Related