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第五章 分子生物学研究法（上）

第五章 分子生物学研究法（上）. ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 第一节 DNA重组技术 第二节 DNA操作技术. 分子生物学研究法 重要性 促进了分子生物学研究的高速发展 主要内容 基因操作 基因工程技术. 基因操作 DNA分子的切割和连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 定点突变 PCR扩增. 基因工程. 定义 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体 分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的 宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达 根本特征 跨越天然物种屏障. 目录 DNA重组技术

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第五章 分子生物学研究法（上）

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Presentation Transcript

  1. 第五章分子生物学研究法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 第一节DNA重组技术 第二节DNA操作技术

  2. 分子生物学研究法 重要性 促进了分子生物学研究的高速发展 主要内容 基因操作 基因工程技术

  3. 基因操作 DNA分子的切割和连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 定点突变 PCR扩增

  4. 基因工程 定义 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体 分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的 宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达 根本特征 跨越天然物种屏障

  5. 目录 DNA重组技术 DNA重组技术概述 工具酶 克隆载体 细菌转化 DNA操作技术

  6. DNA重组技术 将不同的DNA片段（如某个基因或基因的 一部分）按照人们的设计定向连接起来，在 特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表 达，产生影响受体细胞的新的遗传形状

  7. 重组DNA技术的基本步骤 四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞

  8. DNA重组技术 质粒DNA 供体DNA 酶切 酶切 目的基因片段 酶接 重组质粒 转入 染色体DNA 重组质粒

  9. 目录 DNA重组技术 DNA重组技术概述 工具酶 克隆载体 细菌转化 DNA操作技术

  10. 重组DNA实验中常见的主要工具酶

  11. 限制性酶和修饰性酶 细菌通过甲基化和非甲基化DNA来区分自 己细胞的DNA和外来细胞的DNA 自然条件下，外来细胞DNA进入细菌的方 法是病毒感染细菌 细菌抵御病毒的方式是：用修饰性酶将自 身的DNA甲基化，同时，用限制性酶切开外 来DNA

  12. 限制性酶和修饰性酶 限制性酶能切开特定位点的DNA双链 修饰性酶能对相同位点的DNA双链进行甲基化，一般是对A或C 一旦甲基化后，限制性酶就切不开了

  13. 属系株序 命名 Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。

  14. 限制性内切酶的例子 4bp切开的 片段太多 6bp 正好

  15. 8bp切开的 片段太少

  16. GGATCC CCTAGG 限制性内切酶识别序列特点——回文结构(palindrome) 即反相重复结构，是DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。 切口：平端切口、粘端切口

  17. 平头末端 粘性末端

  18. 粘性末端有利于不同的基因连接

  19. DNA连接酶 DNA连接酶发现两个DNA 片段末端相接时，会自动 连接两个片段 DNA连接酶连接粘性末端 的DNA比平头末端的成功 率高 一般平头末端的DNA片段 很难粘接，除非用T4的 DNA连接酶

  20. 目录 DNA重组技术 DNA重组技术概述 工具酶 克隆载体 细菌转化 DNA操作技术

  21. 载体的选择标准 • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

  22. 个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 • 质粒：10kb • λ噬菌体：23kb • 黏粒：45kb • BAC：350kb • YAC：1000kb

  23. 多拷贝质粒载体 最初的质粒直接用作载体 但现在的质粒都经过一些预处理才用作载 体 去除能够杀菌的基因大肠杆菌素(colicin) 增加能够对抗抗生素的基因ampicinlin resistancegene(简称Amp) 用ampicinlin除去没有加入抗生基因的质粒

  24. 多拷贝质粒载体

  25. 将基因插入到载体中1/2

  26. 将基因插入到载体中2/2

  27. multiplecloningsite(MCS) 问题 质粒被切开的位点不止一个 DNA插入的位置影响质粒的复制 解决方案 人工合成的多克隆位点（约50bp），将要切开的位点集中在一段 DNA内

  28. 检测质粒中的插入片段：方法1 酶切法：从细菌中提取出质粒→加入当时 插入DNA所用的限制性内切酶 若不含插入DNA的片段，环状质粒变成线状质 粒 若含有插入DNA的片段，除了线状质粒，还有 插入的DNA片段

  29. 检测质粒中的插入片段：方法2 插入失活法：在插入位点引入第二种抗生素基因 左图（没插入DNA）：能够抵抗两种抗生素#1和#2 右图（插入DNA）：只能够抵抗抗生素#1

  30. 检测质粒中的插入片段：方法3 蓝白斑筛选法：应用β-galactosidase（β-半乳糖 苷酶）和X-gal（X-半乳糖苷） X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物 ，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用 于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选

  31. 检测质粒中的插入片段：方法3 质粒DNA中引入lacZα基因，能表 达出β-半乳糖苷酶的α片段 细菌染色体中将lacZ基因的α段去 掉，表达除了α片段之外的片段 α片段和余下的片段能够组装成活 性的β-半乳糖苷酶，使得显现蓝 色

  32. 检测质粒中的插入片段：方法3 在lacZα引入多克隆位点以插 入DNA 若DNA未插入（上图），能够 生成活性的酶，显现蓝色； 若DNA插入（下图），不能生 成活性酶显现白色。

  33. 检测质粒中的插入片段：方法3

  34. 目录 DNA重组技术 DNA重组技术概述 工具酶 克隆载体 细菌转化 DNA操作技术

  35. 细菌转化 转化（transformation） 将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状 感受态细胞（Competent cells）： 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称~

  36. 常用的转化方法： • 化学转化（CaCl2）法 • 电击法

  37. 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。

  38. 电击转化： 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 菌液：生长对数期 场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm 温度：0-4℃

  39. 目录 DNA重组技术 DNA操作技术 DNA的提纯

  40. 提纯DNA：除去蛋白质

  41. 提纯DNA：除去RNA

  42. 小结 限制性内切酶的来源，分类，用途 DNA重组技术中的常见载体：质粒载体 蓝白斑筛选法 DNA提纯的过程

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