《 食品生物化学实验 》 课程

1. 《食品生物化学实验》课程 授课教师 杨明13809218956 ym_1956@163.com 何梦辉 13049639900 Yangquan7208@vip.163.com 林丽超13535617155 linlichao2087@163.com

3. 实验一 可溶性糖含量测定(4学时) 《食品生物化学实验》课程

4. 一、实验目的 1、学会使用721型或722型分光光度计 2、掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法 二、实验原理 在浓硫酸的脱水作用下，蒽酮能与糖类（包括多糖在内）作用生成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在10-150 µg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 µg左右就能进行测定，所以可作为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较适合。其绿色深浅与糖的含量一致。 糠醛衍生物（蓝绿色） 己糖 羟甲基糠醛+蒽酮

5. 三、实验步骤 1、蔗糖标准曲线制作： 分别吸取0.1mg/ml蔗糖标准液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml放入大试管中，每管中加入蒽酮～醋酸乙酯试剂0.5ml；然后沿每管管壁缓缓加入5ml浓硫酸，先将试管轻摇一下，待醋酸乙酯水解后，再猛摇试管数次（注意勿将硫酸溅出）使液体充分混匀，立即放入沸水浴中保温1min，取出置试管架上，冷却后倒入比色杯，以空白做参照在波长620nm下比色，读取光密度。以蔗糖含量（µg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘出标准曲线（直线方程y=ax+b和决定系数R2≥0.95）。

6. Excel绘制蔗糖标准曲线：（右键打开Excel有标准线性方程作图参考）Excel绘制蔗糖标准曲线：（右键打开Excel有标准线性方程作图参考）

7. 取6支试管，分别按下表加入试剂：

9. 2、样品提取： 剪碎混匀的新鲜样品1g，放入大试管中，加蒸馏水10ml，置沸水浴中加热提取20min，冷却后过滤入100ml容量瓶中，冲洗残渣1~2次，定容至刻度。

10. 过滤、定容

11. 3、测定： 取大试管3支（三次重复），用0.1ml移液管吸取样品提取液0.1ml（100µg）移入大试管底部，再加1.9ml蒸馏水，0.5ml蒽酮～醋酸乙酯试剂，然后沿管壁缓缓加入5ml浓硫酸，按制作标准曲线同样操作方法显色，冷却后，在波长620nm下比色，读取光密度（注意每批测定设一空白校正透光度至100）。根据OD 620平均值代入直线方程公式计算（或在标准曲线上查出）提取液的含糖量（µg），再代入可溶性糖公式计算。

12. 四、实验结果 • 在Excel绘制蔗糖标准曲线，并求出标准线性方程。 • 以表格形式列出实验数据，由标准线性方程求出提取液中糖的量，按下式计算待测样品的糖含量。

13. 五、讨论分析 1、要做好这个实验应注意哪几个环节？绘制标准曲线的目的是什么？ 2、试述蒽酮比色法的适用范围。 3、对得出的可溶性糖实验结果加以分析？ 六、改进实验建议

14. 附：仪器和试剂 • 主要仪器：分光光度计，天平，水浴锅，吸管等。 • 蒽酮—醋酸乙酯试剂：1g蒽酮溶解于50ml醋酸乙酯中，为促进溶解可用温水浴微微加热，该试剂不可久贮，最好用前临时配置。 • 10mg/ml蔗糖标准液：取分析纯蔗糖1.00g，在小烧杯中加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加0.5ml浓硫酸，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为含蔗糖10mg/ml的标准液（由于硫酸的作用，实际上成为含葡萄糖与果糖各一半的转化糖溶液），该溶液可以长期保存。 • 0.1mg/ml蔗糖标准液：精确吸取10mg/ml蔗糖标准液1ml，移入100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即为0.1mg/ml标准液，该溶液应现用现配。 • 浓硫酸（化学纯）比重1.84。

15. VIS-7220N可见分光光度计仪器使用操作说明 一、键盘的使用说明 波长范围：320nm～1100nm 光度范围：0%τ～200%τ, -0.300A～3.000A MODE： 在测量模式、曲线模式间循环切换。 100%： 在测量模式下将透过率调百、吸光度调零； 0%： 在测量模式下将透过率调零；

16. VIS-7220N分光光度计

17. 黑色棒：按100%对0对照比色皿：按100%对0 分光光度计

18. 二、仪器的测量功能 1．仪器测量前的调整 1）打开仪器开关，仪器将自动进入标准测量模式，将仪器预热15分钟后即可进行测量。 2）旋转波长旋钮，使波长显示窗示数为测量波长。 3）将空白溶液、挡光块放入样品池，并关好样品室门。 4）将空白溶液拉入光路，按100%键进行调百，待液晶显示T值为100％时表示已调整完闭。 5）将挡光杆拉入光路，观察T值是否显示为零，如不是则按0%键调零。 6）将空白溶液再次拉入光路，观察T值是否为100％，如不是则再次进行调百调零直至参比的透过率（T）测量值为100％，档光块透过率（T）测量值为0％时完成仪器的调整。 注意：如果需要在另一个波长进行新的测量时可以不进行预热，需从步骤2开始重新进行调整。

19. 2．透射比与吸光度的测量 • 在完成仪器的调整后，将样品放入样品池，将其拉入光路中，此时所显示的T与A值便是此样品的透过率与吸光度值。 • 注意：在测量过程中如果发现在拉入挡光杆时透过率不为0，拉入空白溶液时透过率不为100％，并已超过误差范围时，需重新进行仪器的调整。