Ósmosis y Permeabilidad en el eritrocito

1. Ósmosis y Permeabilidad en el eritrocito Laboratorio de Fisiología para Medicina Karen Acuña Johel Cascante Pedro Rivas Edgardo Soto

2. OBJETIVOS • Determinar la relación entre la forma y el volumen del eritrocito con la tonicidad del medio al que se expone. • Observar la relación que existe entre gradientes crecientes de osmolaridad de soluciones salinas y el porcentaje de hemólisis de los eritrocitos mediante el espectofotómetro para determinar la curva de fragilidad osmótica. • Comparar la velocidad de hemólisis (s) de los eritrocitos en relación con el grado de permeabilidad de diferentes moléculas en concentraciones isoosmolares con el plasma.

3. I. Observación de los cambios morfológicos de los eritrocitos Resultados

4. Observación de los cambios morfológicos de los eritrocitos A C B Figura 1. Dibujo de Eritrocitos al 4% visto desde un microscopio (40X) : a) eritrocito en un medio isotónico, b) eritrocito en un medio hipertónico c) eritrocito en un medio hipotónico. Fuente: Laboratorio de Fisiología, UCR. 2010.

5. Observación de los cambios morfológicos de los eritrocitos Fuente: Blog de recursos educativos para trabajar contenidos de las ciencias naturales. http://auladenaturales.wordpress.com/page/5/?archives-list=1http://www.youtube.com/watch? v=EA_ss8ZkjAM. Revisada el 18 de marzo de 2011.

6. ARTICULO • Franco R. et al. (2008). Autocrine Signaling Involved in Cell Volume Regulation: The Role of Released Transmitters and Plasma Membrane Receptors. Journal of Cellular Phisiology, Vol 216. Febrero.

7. Respuesta Regulatoria del Volumen Celular ante Estrés Osmótico • Detección del cambio en el volumen por un sensor • Transducción de esta señal mediante la activación de cascadas de transducción • Ejecución de la respuesta regulatoria

8. Factores que son sensados • Concentración de solutos (<5%) • Grosor de la bicapa (extremo) • Interacciones macromoleculares dependientes de la forma

9. Regulación en Estado “Agudo” • Pérdida neta de osmolitos intracelulares en respuesta al hinchamiento celular (P.R.V.) • Acumulación neta de solutos activos en respuesta a la pérdida de volumen celular (A.R.V.)

10. ARTICULO • Koivusalo, M. Kapus, A. Grinstein, S. (2009). Sensors, Transducers, and Effectors That Regulate Cell Size and Shape.Journal of Biological Chemistry. Vol.284, Marzo.

11. IncrementoRegulatorio del Volumen • Ganancia de solutos inorgánicos y orgánicos • Gradiente de sodio por la Na/K ATPasa y el potencial eléctrico negativo debido al K

12. IncrementoRegulatorio del Volumen • Intercambiadores Na/H • Familia NHE (1-2-4) • Cotransportadores Na-K-Cl • NKCC 1-2 (fosforilados por la reducción en tamaño) • Ganancia de solutos orgánicos • Taurina-Betaína-Inositol-Sorbitol-Glicerofosfocolina • Absorción aumentada del LEC o Biosíntesis Aumentada

13. IncrementoRegulatorio del Volumen • Canales de Cationes Inducidos por Hipertonicidad • HICC son los mayores responsables en varios tipos de células • Paso indiscriminado de cationes alcalinos (entra Na al mismo tiempo que K sale) • Canales TRP • Se ha visto que pueden también promover entrada de Na y ganancia de volumen

14. Incremento Regulatorio del Volumen Fuente: Koivusalo et al, 2009.

15. Parte II. Determinación de la curva de fragilidad osmótica Resultados

16. Figura 2.Porcentaje promedio de hemólisis de una población de eritrocitos de conejo ante diferentes concentraciones de soluciones salinas seriadas. Fuente: Cuadro 1, hoja de recolección de datos, Laboratorio de fisiología para medicina UCR. 10 marzo 2011.

17. Tipos de cambios • Anisoosmóticos Son inducidos por alteraciones en la osmolalidad extracelular Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

18. Tipos de cambios • Isoosmóticos. Cambios isoosmóticos son aquellas alteraciones en el contenido intracelular Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

19. Sensores • Hacinamiento Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

20. Concentración iónica Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

21. Modificación de membrana 1 Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

22. F-Actinina • Dominios de unión a ATP, Ca⁺².

23. Papel de los fosfolípidos. Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

24. PtdIns(4,5)P2 Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

25. Modificación de membrana 2 Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

26. Centro integrador (2008)

27. Canales para K+ y Cl- (VRACs) • Cotransportador electroneutro • KCCs • Canal para Taurina Koivusalo, M. Kapus, A. Grinstein, S. (2009). Sensors, Transducers, and Effectors That Regulate Cell Size and Shape.Journal of Biological Chemistry. Vol.284, Marzo.

28. Canal de K+ • Gradiente electroquímico • Acoplado a salida de Cl- • K2P (Ejemplos: TRAAK, TREK-1, TASK),BK, IK, SK, Kv(1.3, 1.5, 4.2, 4.3) • Reguladores: Familia de las MAPK (SGK), aa, leucotrieno, Ca2+(μM y ηM), estiramiento de la membrana.

29. Canales para aniones • Corriente de aniones reguladora del volumen (VRACs). • VRACs “sensan una reducción en la fuerza iónica intracelular, durante el aumento en el volumen celular”. • Cl- principal sustrato, HCO3- • Osmolitos orgánicos • Reguladores: MAPK (SGK/transcripción), ácidos grasos, Rho GTPase, especies reactivas de oxígeno, Tyrosine-Kinasas y Ca2+.

30. VRACs Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009

31. Cotransportador KCCs • Electroneutro • 4 isoformas • Regulado por ciclos de serina/treonina fosforilación y desfosforilación • Activados por desfosforilación durante el aumento del volumen celular

32. TRPs • Entrada de Ca++ (cationes) • Sensores explícitos de cambios en el volumen • Teorías sobre la activación: • Distención directa de la membrana • La movilización de moléculas de anclaje • La activación de fosfolipasas • La inserción de vesículas del interior de la célula. Al atenuar la función del TRPV 4 y el TRPV 7 se disminuyó la reducción reguladora de volumen en algunas células

33. Salida de Taurina • Flujo modesto • 30-90% cuando la célula aumenta de volumen. • Se sugiere la participación de los VRACs en el transporte de esta y otros metabolitos orgánicos.

34. III. Permeabilidad de la membrana para varias moléculas orgánicas en concentraciones isoosmolares Resultados

35. Figura 3. Tiempo de hemólisis observado durante la aplicación de soluciones isoosmolares con diferentes moléculas a los eritrocitos empacados. Nota: No se observaron tiempos de hemolisis de NaCl y glucosa en el tiempo de laboratorio. Fuente: Cuadro 2, hoja de recolección de datos, Laboratorio de fisiología para medicina UCR. 10 marzo 2011

36. El Peso Molecular de la sustancia. Viscosidad Estructura molecular e impedimento estérico de la molécula. Coeficiente de reflexión Carga de la molécula Concentraciones de la sustancia Factores de moleculares que afectan la difusión

37. Presencia de proteínas de membrana específicas para el transporte de solutos y su grado de expresión en las diferentes células. Expresión de canales iónicos de membrana, su grado de expresión y mecanismos de regulación de su función. Velocidad de transporte de las proteínas acarreadoras y probabilidad de apertura de los canales iónicos. Factores de membrana que afectan la difusión

38. Polaridad y liposolubilidad: La polaridad es mayor en sustancias como el etilenglicol y la etanolamina y más baja en alcoholes como el butanol. A menor polaridad mayor liposolubilidad. Pesos moleculares: Cloruro de Sodio 58,5, Urea 60, Etanolamina 61, Etilenglicol 62, Butanol 74, Isobutanol 74 Tiourea 76, Dietanolamina 105, Glucosa 180. Ramificación de la estructura molecular: El ejemplo más claro el butanol y el isobutanol. Etanolamina – Etilenglicol - Tiourea Dietanolamina - Butanol - Isobutanol

39. Urea UT-B es codificado por el gene Slc14A1 ubicado en el cromosoma 18 Este transportador es el causante de los bajos tiempos de hemólisis registrados para la urea FUENTE: Serena M. Bagnasco. The Erythrocyte Urea Transporter UT-B. Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland 20187, USA 2006

40. El GLUT-1 es especialmente importante en tejidos cuyo metabolismo energético depende altamente de la glucosa. Alta afinidad por la glucosa (Km= 1-2mM) El gen del GLUT-1 se ubica en el cromosoma 1p35.31.3 y codifica para una proteína de 492 aminoácidos con un peso molecular de 54,2 kDa 5% del peso total de la membrana del eritrocito. Glucosa Bermúdez; V et. Al. Biología molecular de los transportadores de glucose: clasificación, estructura y distribución. Sociedad Venezolana de Farmacología Clínica y Terapeútica. 2007.

41. NaCl Na+/K+ ATPasa utiliza la energía del ATP para transportar 3 moléculas de sodio fuera de la célula y a la vez hacer ingresar a ella 2 moléculas de potasio manteniendo una regulación en su volumen.

42. CONCLUSIONES • Los eritrocitos son células que poseen una capacidad limitada de regulación de su volumen. Por eso en un medio altamente hipotónico tienen una gran entrada de agua y sufren un hinchamiento considerable, pudiendo incluso llegar a hemólisis; mientras que en medios hipertónicos experimentan una pérdida de volumen que ocasiona que sufran un proceso de crenación.

43. CONCLUSIONES • Cuando exponemos una muestra de eritrocitos a diferentes medios con concentraciones salinas seriadas podemos ver que el comportamiento no es constante. Podemos apreciar que en los niveles más cercanos a osmolaridades fisiológicas el eritrocito es capaz de manejar los cambios, pero en concentraciones menores extremas los mecanismos se ven superados, y el eritrocito presenta niveles de hemólisis mayores.

44. CONCLUSIONES • Se observa semicuantitativamente que sustancias con características que favorecen la difusión a través de la membrana celular del eritrocito presentan un menor tiempo de hemólisis.

45. MUCHAS GRACIAS!! PREGUNTAS???

47. Gráfico de regresión no lineal. Figura 4 .Porcentaje promedio de hemólisis de una población de eritrocitos de conejo al 4%, ante diferentes concentraciones (mOsm/L) de soluciones salinas seriadas. Representación gráfica de los datos estadísticos. Fuente: Cuadro 1, hoja de recolección de datos, Laboratorio de fisiología para medicina UCR. 10 marzo 2011.

48. REFERENCIAS • Barbara E. Goodman. Transport of small molecules across cell membranes:water channels and urea transporters.University of South Dakota School of Medicine, Vermillion, South Dakota 57069.2002 • Bermúdez; V et. Al. Biología molecular de los transportadores de glucose: clasificación, estructura y distribución. Sociedad Venezolana de Farmacología Clínica y Terapeútica. 2007. • Briceño, L. (2001). Principios de Fluidoterapia: Utilizacion clínica de soluciones parenterales. Segunda edición. Primera reimpresión. San José, C.R. : EDNASSS. • Cohen, D. M. (2005). SRC FamilyKinases in Cell Volume Regulation.American Journal of Physiology. Vol. 288, Marzo.

49. REFERENCIAS • Franco, R. et al. (2004). Epidermal growth factor receptor is activated by hyposmolarityand is an early signal modulating osmolyteeff pathways in Swiss 3T3 fibroblasts. Cell and molecular physiology, vol. 447, Enero. • H. Pasantes-Morales, et al. (2006). Tyrosine kinases and osmolyte fluxes during hyposmotic swelling.Acta Physiology 2006, Vol 187,Enero. • Hoffman,E. Lambert, I. Et al. Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev. 89. 193-277.2009 • Koivusalo, M. Kapus, A. Grinstein, S. (2009). Sensors, Transducers, and Effectors That Regulate Cell Size and Shape.Journal of BiologicalChemistry. Vol.284, Marzo.

50. REFERENCIAS • Lezama, R., Díaz.-Tellez, Ramos G. (2005). Epidermal Growth Factor Receptor is a Common Element in the Signaling Pathways Activated by Cell Volume Changes in Isosmotic, Hyposmotic or Hyperosmotic Conditions. NeurochemicalResearch, Vol. 30, No. 12, Diciembre. • Michael J. Seatter and Gwyn W. Gould.The Mammalian Facilitative Glucose Transporter (GLUT) Family. Division of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, Scotland. Membrane Transporters as Drug Targets, edited by Amidon and Sadée. Kluwer Academic/Plenum Publishers,New York, 1999. • Ross, M. et al. (2006). Histología: Texto y Atlas a color con Biología Celular y Molecular. Editorial Médica Panamericana.