酿酒葡萄的次生代谢 和逆境栽培管理

1. 酿酒葡萄的次生代谢和逆境栽培管理 黄卫东 中国农业大学葡萄酒科技发展中心

2. 植物的初生代谢及初生代谢产物（Primary metabolites）是维持细胞生命活动所必需的。 • 但是，植物在长期的进化过程中，植物遇到各种各样的逆境，包括生物逆境和非生物逆境，为了生存和适应这些逆境，植物逐步分化出次生代谢。

3. 植物的次生代谢产物（Secondary metabolites）是指植物体中一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物。其产生和分布通常有种属、器官组织、生长发育期和遭遇逆境的特异性。 • 植物的次生代谢即指次生代谢物在植物中合成与分解的过程。

4. 一些小分子有机物在代谢途径上与次生代谢比较相似或有关，但是，它们具有明显的生理功能，如萜类物质赤霉素、脱落酸等，它们被称为植物生长调节物质或植物激素，目前，不把它们视为次生代谢物。但是，随着科学的深入，植物的次生代谢物的概念会发生改变。一些小分子有机物在代谢途径上与次生代谢比较相似或有关，但是，它们具有明显的生理功能，如萜类物质赤霉素、脱落酸等，它们被称为植物生长调节物质或植物激素，目前，不把它们视为次生代谢物。但是，随着科学的深入，植物的次生代谢物的概念会发生改变。

5. 次生代谢是植物在长期的进化过程中对生态环境适应的结果。次生代谢是植物在长期的进化过程中对生态环境适应的结果。 • 许多植物在受到病原微生物侵染后，产生并积累次生物质，用以增强自身的抗性，这些小分子物质称为植保素（Phytoalexin）。如很多的萜类、生物碱和异黄酮等。 • 一些次生代谢物，如水杨酸、茉莉酸等，作为信号分子参与调控植物的生理活动。

6. 酿酒葡萄的次生代谢产物是酿酒葡萄果皮和果肉代谢库的主要成分，它在品质调控上具有重要的作用，甚至决定了葡萄和葡萄酒的质量。酿酒葡萄的次生代谢产物是酿酒葡萄果皮和果肉代谢库的主要成分，它在品质调控上具有重要的作用，甚至决定了葡萄和葡萄酒的质量。

7. 一、酿酒葡萄次生代谢产物的类型 • 酿酒葡萄的次生代谢产物很多，一般归类为三大类，酚类化合物、萜类化合物和含氮化合物。主要有：酚类、黄酮类、糖苷、生物碱、萜类、香豆素、有机酸等。

8. 1、酚类 • 广义的酚类包括黄酮类、简单酚类和醌类。莽草酸途径是这些芳香族化合物的来源的主要途径。 • 1.1 黄酮类 • 是一大类以苯色酮环为基础，具有C6、C3、CH6结构的酚类化合物。

9. 黄酮类化合物的生物合成前体为苯丙氨酸和马龙基辅酶A(Malonyl CoA)。 • 根据B环的连接位置不同可分为2-苯基衍生物（黄酮、黄铜醇等）、3-苯基衍生物（异黄酮）和4-苯基衍生物(新黄酮）。 • 根据其三碳结构的氧化程度可分为花色苷类、黄酮类、黄酮醇类以及黄烷酮类。

10. 黄酮类是酿酒葡萄和葡萄酒的主要成分。很多黄酮类有利于人的心血管系统的保护和有关疾病的治疗；许多异黄酮类在酿酒葡萄植物中作为植保素存在。黄酮类是酿酒葡萄和葡萄酒的主要成分。很多黄酮类有利于人的心血管系统的保护和有关疾病的治疗；许多异黄酮类在酿酒葡萄植物中作为植保素存在。

11. 1.2 简单酚类 • 是含有一个被羟基取代苯环的化合物。具有调节植物生长的作用，有些也是植保素的重要成分。

12. 1.3 醌类 • 由苯式多环烃碳氢化合物（如萘、蒽等）衍生的芳香二氧化合物。可分为苯醌、萘醌及蒽醌等。 • 醌类的存在是植物呈色的主要原因之一。

13. 2、萜类 • 萜类是异戊烯单元（5碳）组成的化合物，通过异戊二烯途径（又称甲羟戊酸途径）产生。

14. 2.1 低等萜类 • 由2个、3个和4个异戊烯单元分别组成单萜、倍半萜和二萜。 • 单萜和倍半萜是酿酒葡萄挥发油的主要成分，也是香料的主要成分。 • 许多倍半萜和二萜化合物也是植保素。

15. 2.2 高等萜类 • 甾类化合物和三萜的合成前体都是含30碳原子的鲨烯。甾类化合物由1个环戊烷并多氢菲母核和3个侧链基本骨架组成。 • 植物体内三萜皂苷元和甾体皂苷元分别与糖类结合形成三萜皂苷和甾体皂苷。 • 胡萝卜素类也是高等萜类，但是，一般不把它划在次生物质内。

16. 3、含氮化合物 • 3.1 生物碱 • 是一类含氮的碱性天然产物。有2000多种。有些也是植保素。 • 3.2 胺类 • 是NH3中的氢的不同取代产物，根据取代基数分为伯、仲、叔、季胺4种。通常由氨基酸脱羧或醛转氨而产生。

17. 3.3 非蛋白氨基酸 • 是不组成植物蛋白的氨基酸，常有毒。多集中豆科植物中，酿酒葡萄尚未发现。 • 4、有机酸等 • 有机酸广泛分布于植物各部位。有些有机酸如茉莉酸是植物重要的信号分子。

18. 二、与酿酒葡萄抗病栽培有关的次生代谢产物 • 适应和抵抗逆境的作用是植物次生代谢物的一个重要生理功能，是植物长期进化的结果。 • 参与防卫的次生物质很多，包括各种类型的植保素、木质素和其他一些次生代谢物。

19. 1、植保素 • 植保素是植物受侵染后产生的一类相对分子质量（Mr)较低的抗病原物的次生物物质，其产生的速度和积累的量与植物的抗病性有关。 • 异黄酮豌豆素是第一个被分离鉴定的植保素。植保素成分类型不一，其中研究最多的是黄酮类和萜类。

20. 植保素是受诱导产生的，致病或不致病的小种均能诱导植保素的形成，一些非生物因素如紫外光、重金属等也可诱导植保素的产生。近年来发现，一些真菌培养液滤液和菌丝体提取物（称为诱导物，Elicitor）也能诱导植保素的形成。植保素是受诱导产生的，致病或不致病的小种均能诱导植保素的形成，一些非生物因素如紫外光、重金属等也可诱导植保素的产生。近年来发现，一些真菌培养液滤液和菌丝体提取物（称为诱导物，Elicitor）也能诱导植保素的形成。

21. 此外，还有许多次生代谢物质在植物的防御机理中起作用，它们通常在酿酒葡萄受到侵染后发生量和质的变化，如原儿茶酚和儿茶酚、绿原酸等。此外，还有许多次生代谢物质在植物的防御机理中起作用，它们通常在酿酒葡萄受到侵染后发生量和质的变化，如原儿茶酚和儿茶酚、绿原酸等。

22. 2、作为系统获得性抗性反应（SAR）中的信号分子2、作为系统获得性抗性反应（SAR）中的信号分子 • 植物在受到病源菌侵染或非生物逆境后，引发局部防御反应——过敏反应，导致侵染或受伤部位积累抗性物质，或限制或杀伤病原菌，或破坏自身局部细胞结构，形成防护层；另外，同时导致信号分子的产生，信号分子的传输又引发植物的其他部位产生抗性反应，这就是系统获得性抗性反应（SAR）。

23. 一些次生代谢物质作为信号分子参与了酿酒葡萄系统获得性抗性反应（SAR）。一些次生代谢物质作为信号分子参与了酿酒葡萄系统获得性抗性反应（SAR）。 • 如SA，就是近年来研究的热点，并取得了很大的进展。在生物或非生物逆境下，酿酒葡萄的SA明显增加，显示明显的信号分子特征，外施SA可以明显诱导产生防卫蛋白，如几丁质酶、过氧化酶系统等，诱导与抗性相关的蛋白的基因转录，又诱导次生代谢等。

24. 又如茉莉酸（JA），也是近年来研究较多的信号分子，特别是作为伤信号分子。又如茉莉酸（JA），也是近年来研究较多的信号分子，特别是作为伤信号分子。 • JA可以明显诱导与抗伤害有关的基因的表达和蛋白转录，提高抗伤害能力。

25. 三、次生代谢途径关键酶的分子克隆与调控 • 次生代谢产物的前体有：乙酸、莽草酸以及甲羟戊酸等少数几个。它们产生于初生代谢，经过酶催化形成几大类基本骨架，再由各种类型的酶促反应进行修饰，产生各种各样的次生代谢产物。 • 一些可诱导的代谢关键酶基因已经被克隆，打下了植物防御反应调控机制研究的基础。

26. （一）代谢关键酶基因的克隆

27. 1、苯丙烷类代谢酶系 • 黄铜类植保素、木质素、SA等的生物合成都是通过苯丙烷类生物合成途径。许多酶已经克隆。 • 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（CA4H）和4-香豆酸CoA连接酶（4CL）是这个途径的关键酶。

28. 1.1 果实发育期，苯丙烷类代谢酶系的表达和SA的调控 • PAL和4CL常常为多个成员组成的基因家族所编码，PAL有的多达20多个，不同的基因的表达受发育和环境信号的调节。

29. DNA 28s 18s 葡萄果实发育过程中原花色素合成相关酶转录水平的变化规律

30. Skin Cabernet Sauvignon Chardonnay PAL CHS F3H DFR LDOX M 20d 40d 70d 90d 100d M 20d 40d 70d 90d 100d

31. Flesh Cabernet Sauvignon Chardonnay PAL CHS F3H DFR LDOX M 20d 40d 70d 90d 100d M 20d 40d 70d 90d 100d

32. Seed Cabernet Sauvignon Chardonnay PAL CHS F3H DFR LDOX M 20d 40d 70d 90d 100d M 20d 40d 70d 90d 100d

33. 果实发育过程中，原花色素合成相关酶表达受到严格的控制，与果实发育时期密切相关；且不同部位表达规律互不相同。果实发育过程中，原花色素合成相关酶表达受到严格的控制，与果实发育时期密切相关；且不同部位表达规律互不相同。 • 赤霞珠果皮中，各基因均在幼果期和成熟期大量表达；而霞多丽果皮中，则仅在幼果期大量表达（PAL例外，成熟期表达量也较高）。 • 果肉中，各基因均在幼果期大量表达，而随果实发育，表达量有所下降。 • 种子中各基因表达与果肉相似。

34. SA明显诱导相关基因表达 • SA孵育果实（花后70天，转色期）圆片 • SA低压渗透（花后100天，成熟期） • PAL、CHS、F3H、DFR、LDOX基因表达变化规律

35. 探针制备 探针序列同源性 Identity of probe sequence

36. M CK 30min 1h 3h 5h M CK 8h 16h 24h 32h 48h 圆片孵育 低压渗透 cDNA 定量

37. CK 30min 1h 3h 5h CK 8h 16h 24h 32h 48h PAL CHS F3H DFR LDOX 圆片孵育 低压渗透

38. SA能够诱导葡萄果实PAL、CHS、F3H、DFR、LDOX的表达。SA能够诱导葡萄果实PAL、CHS、F3H、DFR、LDOX的表达。 • 不同处理方式，各基因响应时间不同。圆片处理，各基因均在处理后30 min表达量达最大值。而低压渗透则在16、24h表达量达最大。

39. 1.2 查耳酮合成酶（CHS）基因的克隆与T载体的构建 • 查尔酮合成酶（CHS）是将苯丙烷代谢途径引向黄酮类合成的第一个酶。我们以酿酒葡萄为试材，进行了查耳酮合成酶（CHS）基因的克隆与T载体的构建。

40. 查耳酮合成酶（CHS）二聚体结构

41. CHS PCR克隆葡萄chs全长基因 图 2.1： PCR克隆chs全长基因 Fig.2.1. PCR amplification.

42. PCR产物凝胶回收 图2.2：PCR产物凝胶回收电泳检测 Fig.2.2. Agarose-gel electrophoresis of purified PCR product（1225 bp） stained with ethidium bromide.

43. T载体构建示意图 图2.3：pMD -chs重组质粒构建图 Fig.2.3. Construction of the recombined pMD –chs plasmid.

44. 重组质粒的鉴定 图2.4：重组质粒的鉴定 Fig.2.4. Identification of the insertion of the recombined plasmid

45. 1. 实验使用高保真的TaKaRaEx Taq DNA polymerase，以chs质粒DNA为模版，进行PCR反应，经过小提质粒、酶切鉴定和测序鉴定得到葡萄chs全长基因，与Sparvoli等（1994）在葡萄叶片克隆的结果同源性达到99％，且开放阅读框没有移码错误，为进一步构建表达载体奠定坚实的基础。 • 2.实验在设计引物的时候在引物两端添加了EcoR I和Sal I双酶切位点（Takara），除了具备其切割后产生不同的粘性末端外，同时通用buffer的使用能够明显的提高切割效率。

46. 原核表达载体pET-chs的构建 • IPTG诱导下在大肠杆菌中高效表达CHS融合蛋白 • Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化

47. 双酶切并回收纯化目的chs & pET-30a（+）片段 图3.1：EcoR I和Sal I双酶切回收chs和pET-30a (+)片断 Fig.3.1. Digestion with EcoR I and Sal I of pMD-chs and pET-30a (+)

48. 原核表达载体的构建 图3.2.：原核表达载体pET-chs构建图 Fig.3.2. Construction of the recombined expressedplasmid pET-chs.

49. 重组表达质粒的鉴定 图3.3：酶切鉴定重组表达质粒 Fig.3.3. Identification of the plasmid pET-chs by digestion with restriction enzymes

50. IPTG诱导表达原核蛋白 图3.4： IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌中的原核表达（SDS-PAGE分析） Fig.3.4. Expression of fusion pET-CHS protein in E.coli strain BL21(DE3) pLysS under inducing by IPTG (SDS-PAGE assay)