第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础 第一节限制性内切酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶第四节 DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节 RNA酶

第二节 DNA连接酶 剪刀—限制性内切酶针线、胶水—连接酶

第二节 DNA连接酶 DNA连接酶

第二节 DNA连接酶 一、概念与机理 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（ OH ）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。

第二节 DNA连接酶 一、概念与机理 DNA连接酶只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。注：关于“Gap”与“Nick”的概念。 1.Gap裂口：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。 Gap in DNA is the absence of one or more nucleotides in one strand of duplex. 2.Nick缺口：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了(移走了)一个磷酸二酯链。 Nick in duplex DNA is the absence of a phosphodiester bond between two adjacent nucleotides on one strand. 注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！！！！！

第二节 DNA连接酶 DNA连接酶对不同DNA分子的连接作用

第二节 DNA连接酶 二、DNA连接酶的种类（一）T4噬菌体DNA连接酶特点：只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基用途： 1) 粘性末端的连接 2) 平头末端的相连抑制剂: PO43->5mM , NaCl>25mM, Ca2+>0.1mM

第二节 DNA连接酶 DNA连接酶的部分性质二、DNA连接酶的种类 (二）大肠杆菌DNA连接酶　　连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子 (三）热稳定DNA连接酶　　以NAD为辅助因子，优先作用于缺口连接酶使用注意事项 1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接； 2)只能连接双链DNA分子的单链切口(nick)； 3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（gap）。

第二节 DNA连接酶 DNA连接酶应用图解（一）分子间的连接（二）分子内的连接

第二节 DNA连接酶 三、DNA连接酶的反应体系四、影响连接反应的因素 1. 插入片段与载体的浓度比例：2-10:1 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象 2. 反应温度：一般4~16℃ 3. ATP浓度

第二节 DNA连接酶 平末端DNA片段的连接(补充) 1.同聚物加尾法

第二节 DNA连接酶 平末端DNA片段的连接(补充) 2.衔接物连接法

第二节 DNA连接酶 问：衔接物和DNA接头有什么区别？？？平末端DNA片段的连接(补充) 3.DNA接头（adaptor）连接法衔接物（linker）是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 DNA聚合酶（DNA polymerase)是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶I 1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。

CCG GGCTATCGG E.coli DNApolI CCGATAGCC GGCTATCGG Mg 2+，4dNTP 5′ TCGATAGCC AGCTATCGG GATAGCC AGCTATCGG Mg 2+ + pC，pT E.coli DNApolI TCGATAGCC AGCTAT TCGATA AGCTAT Mg 2+ 5′ + pC，pG，pC E.coli DNApolI 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 DNA聚合酶的三种活性 1. 5’→3’聚合酶活性 2. 5’→3’外切酶活性 3. 3’→5’外切酶活性

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶I 用途： 1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 2）补齐5’-突起端 3）合成第二条cDNA 4）切口移位制备探针其中用途2) 和3)常用大片段

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 二、Klenow片段（一）基本性质　　　大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。 Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶活性。

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 二、Klenow片段（二）用途 1. 3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 2. DNA 3’末端标记:在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow 5’ klenow 5’

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 • 二、Klenow片段 • （二）用途 • 3. cDNA第二链的合成 mRNA 5’ 3’ 逆转录 3’ 5’ cDNA第一链引物 klenow 3’ cDNA第二链 5’

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 三、T4噬菌体DNA聚合酶（一）T4 DNA酶的基本特性　　　有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解单链更快）。在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切　　　在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 三、T4噬菌体DNA聚合酶（二）用途

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶（一） T7噬菌体DNA聚合酶　　　从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个。　（二） T7噬菌体DNA测序酶　　　通过对T7DNA聚合酶进行化学修饰，去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 五、Taq DNA聚合酶来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：单亚基MW=94000d。特点：热稳定性，70℃ 反应 2 h残留活性为原来的90%； 93℃ 反应 2 h残留活性为原来的60% ；94℃ 反应 2 h残留活性为原来的40%。活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’ →5 ’外切酶活性，具5’→3’外切活性。　用途： 1. PCR反应。 2. 测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 • 五、逆转录酶（reverse transcriptase） • 　　　依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 • 来源商品反转录酶有两种： • 来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(42℃)。 • 来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli(37 ℃)。结构和活性：

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 五、逆转录酶（reverse transcriptase）用途： (1) 5’→ 3’聚合酶活性, 能以RNA或DNA模板合成DNA分子； (2) RNA酶H活性：对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。 (3)用于３’凹陷末端的标记，杂交探针的制备和DNA序列测定。

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 五、逆转录酶（reverse transcriptase） RNaseH活性

第四节　DNA修饰酶 一、末端脱氧核苷酸转移酶来源及特点：　　　　简称末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OH DNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA。用　途： 1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。 2. 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。 3. 用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。

第四节　DNA修饰酶

第四节　DNA修饰酶 末端转移酶功能图解 3‘突出末端

第四节　DNA修饰酶 二、T4噬菌体多核苷酸激酶来源从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。用途：DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 -OH HO- 5’ 3’ 5’ HO- 3’ -OH ATP T4多核苷酸激酶 5’ 3’ -OH P- HO- 3’ 5’ -P

第四节　DNA修饰酶 三、碱性磷酸酶 1）碱性磷酸酶种类细菌性碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase，BAP），从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。小牛肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase，CIAP），从小牛肠中纯化出来。加热68 ℃可完全失活。 2）碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 P- 5’ -OH 3’ HO- 5’ 3’ -P 碱性磷酸酶 3’ -OH 5’ HO- 5’ -OH HO- 3’

第四节　DNA修饰酶

第四节　DNA修饰酶 3)碱性磷酸酶的功能防止线性化的载体份子自我连接其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。

第五节外切酶核酸（自学） 核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。一、作用于单链的核酸外切酶如：大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）；大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ）二、作用于双链的核酸外切酶如：大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）；噬菌体核酸外切酶（ exo）；T7噬菌体基因6核酸外切酶三、既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶如：Bal 31核酸酶

第五节外切酶核酸 不同核酸外切酶的特性比较

第五节外切酶核酸

第六节单链内切核酸酶 一、S1核酸酶来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。　注意：对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。酶量大可完全消化双链，中量，可在切口或小缺口处切割双链用途： (1)测定核酸分子的杂交程度； (2)去除DNA片段中突出的单链尾巴； (3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。

第六节单链内切核酸酶 一、S1核酸酶

第六节单链内切核酸酶 一、S1核酸酶 S1的用途：合成CDNA时切除单链环

第六节单链内切核酸酶 二、脱氧核糖核酸酶I （DNase I）　　来源于牛胰脏，分子质量为31ku，是一种糖蛋白。用途： 1.与大肠杆菌DNA聚合酶I一起参加切口平移 2.制作DNA文库 3.使用DNaseI足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点 4.去除转录产物中的模板DNA

第七节 RNA酶 一、核糖核酸酶A（RNase A）　　　来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶。可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3‘端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。反应终产物是嘧啶3’磷酸及末端带嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。用途：　（1）从DNA-RNA或RNA-RNA杂合体中去除未杂合的RNA区　（2）确定DNA或RNA中单碱基突变的位置　（3）RNA检测　（4）降解DNA制备物中的RNA分子

第七节 RNA酶 二、核糖核酸酶H （RNase H）　　　核糖核酸酶H(RNaseH)催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的核内降解，产生不同链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核糖核酸。用途：　在cDNA克隆，合成第二链之前去除RNA 。

小　结

习题酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N

1. 片段大小2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 2. 两单酶切成三个片段,说明各有两个切点 ------p------- p--------- 750 500 1200 3 .Pst1, 1200, 750不见, 说明: (1) 另外两个酶的切点在其中 ---x-----p------p---x------ Xbo1 500 (2) 两个Pst1酶的切点相距500 500 ---1200--- 4. 1200---300+900(被Xbo1) ---x-----p------p--- x----- 300 900 Pst1距Xbo1为300 --750---- 5. 750—150+600 ----x------p-----p---x----- 150 600 Pst1距Xbo1为600 -------1400------- 6. 1400—600+500+300 ---x------p------p---x----- 600 500 300 -------------2450------------- 7. 2450-150+600+500+300+900 ---x------ p------ p----x----- 150 600 500 300 900

酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N

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