第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础 第一节限制性内切酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶第四节 DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节 RNA酶

基本概念及其生物功能 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 • 根据作用的核酸底物不同: 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA • 按水解断裂核酸分子的方式: 从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶

工具酶 　　　基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。

第一节限制性核酸内切酶 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用

限制性核酸内切酶概念 限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

1. 来源 主要来源于原核生物 2. 性质内切酶即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端 3. 功能自我保护作用细菌的限制和修饰系统（R/M体系）任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制

寄主的限制与修饰现象 E.O.P 成斑率 efficiency of plating phage λ (B) EOP=10-4（限制作用） EOP=1 大肠杆菌B 大肠杆菌K EOP=10-4（限制作用） EOP=1（修饰作用）修饰的phage λ (K) 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。

（1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。

（2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

（3）限制与修饰系统相关的三个基因 ① hsd R: 编码限制性内切酶这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断 ② hsd M: 编码限制性甲基化酶这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。 ③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。

限制和修饰作用的分子机制 1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株，有各自的限制和修饰系统。 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点------（修饰）

3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 ------（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。

限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： • 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示

2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒

3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶 4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。

Escherichia Coli Ry13 EcoR I 属名种名株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

限制性内切酶的类型 目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。

二、限制性内切酶的类型 　　　据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。基因工程中使用注： SAM为S－腺苷甲硫氨酸

Ⅰ型限制性内切酶的基本特性 首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC N：表示任何一种核苷酸

（2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大 Recognize site cut 1-1.5kb （3）辅助因子需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）

A B C C’ B’ A’ A’ B’ C’ C B A Ⅱ型限制性内切酶的基本特性首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是Hind Ⅱ 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。（1）识别位点序列 A B N B’ A’ 或 A’ B’ N’ B A

（2）切割位点 识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：

A A G C T T T T C G A A HindⅢ切割位点 DNA HindⅢ DNA A B C D A A G C T T T T C G A A 核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用

Ⅲ型限制性内切酶的基本特性 在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但不是对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。

IV型限制性内切酶 新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖－羟甲基化的DNA序列。除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。

核酸限制性内切酶的类型及主要特性

识别序列 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。 4bp HpaⅠ C  CGG HaeⅢ GG  CC 5bpAvaⅡ G GWCC EcoRⅡ  CCWGG 6bp BamHⅠG GATTC SmaⅠCCC  GGG11bp Bg1Ⅰ GCCNNNN NGGC 12bp BstXⅠ CCANNNNN NTGC

回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列特点有二： 1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。 2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5’ 3’），其核苷酸顺序相同。 5′···GTNAC···3′ 3′···CANTG···5′ 5′···GAA TTC···3′ 3′···CTT AAG···5′

切割方式 Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。

与II型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端(Blunt end):因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。

EcoRI等产生的5‘粘性末端 5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C … 5’ EcoRI 37 ℃ 5‘…G--C--T--G--OH P--A--A--T--T--C--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--C--T--T--A--A—P OH--G--C--T--C … 5’ 退火4--7 ℃ 5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C … 5’ 1. 5’突出的末端

PstI等产生的3‘粘性末端 5‘…C--T--G--C--A--G… 3’ 3‘…G--A--C--G--T--C … 5’ PstI 37 ℃ 5‘…C--T--G--C--A--OH P--G … 3’ 3‘…G-- P OH --A--C--G--T--C … 5’ 退火4--7 ℃ 5‘…C--T--G--C--A--G… 3’ 3‘…G--A--C--G--T--C … 5’ 2. 3’突出的末端

粘性末端的意义 ① 连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。 ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

② 末端标记 A5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 B 3’末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

PvuII等产生的平头末端 5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C … 5’ PvuII 37 ℃ 5‘…G--C--T--C--A--G--OH P--C--T--G--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--G--T--C--P OH--G--A--C--C--T--C … 5’ 3. 平头末端

平齐末端的特点 连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法 ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。 ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端

同裂酶（Isoschizomer) 不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。 ① 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同如Hind Ⅲ和Hsu I Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’

② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。如Xma I和Sma I。

同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、BglⅡ、Bcl I、Xho Ⅱ等 BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bgl Ⅱ Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’ XhoⅡ U代表嘌呤；Y代表嘧啶。

Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 GATCT-3’ A-5’ 5’-G 3’-CCTAG BamH I Bgl Ⅱ 5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Bgl Ⅱ BamH I Sau 3A

Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件 1. 标准酶解体系的建立一个单位（U）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间

2. 酶解过程 配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定

① 酶解体系 一般20μl，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是： ddH2O buffer DNA 酶

Tris-HCl 50 mM pH 7.5 0 - 50 mM 低盐酶 MgCl2 10 mM 100 mM 中盐酶 NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM 150 mM 高盐酶 Volume 20 - 100 ml Time Temp 37 ℃ 1 - 1.5 hr • 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：

② 混匀 移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。

第二章 基因工程的酶学基础