Elektronenmikroskopie

1. Elektronenmikroskopie ACF-Seminar WS 2005/06 Vanessa Schönig

2. Gliederung • Einleitung • Grundlagen • TEM • REM • EDX • EELS • EFTEM • Beispiel

3. Einleitung • Mit Lichtmikroskopen ist eine Vergrößerung bis etwa 1.000fach erreichbar und sinnvoll • Bei stärkerer Vergrößerung kommt es aufgrund des begrenzten Auflösungsvermögens zu unscharfen Bildern, die keine Strukturen mehr erkennen lassen • Häufig reichen lichtmikroskopische Methoden nicht aus, den Aufbau der Proben aufzuklären => Elektronenmikroskopie

4. Grundlagen • Lichtmikroskop => Licht einer Lampe Elektronenmikroskop=> hochenergetische Elektronen für die Darstellung des Objekts • Schnelle Elektronen haben eine sehr viel kleinere Wellenlänge als sichtbares Licht (→Welle-Teilchen-Dualismus) • Die Auflösung eines Mikroskops ist durch die Wellenlänge begrenzt • Die Auflösung eines Elektronenmikroskops liegt zur Zeit bei etwa 0.1nm. • Die Auflösung eines Lichtmikroskops liegt bei etwa 200nm.

5. Grundlagen Lichtmikroskop: • Strahlungsquelle: Licht einer Lampe • Kondensorlinse fokussiert das Licht auf das Objekt • Objektivlinse und Okular bilden eine vergrößerte Darstellung des Objekts in der Bildebene (=Auge) ab Quelle: http://www.zoologie-skript.de/methoden/mikros/tem.htm

6. Grundlagen Elektronenmikroskop: • Die Strahlenquelle ist eine Kathode (z.B. ein Wolframdraht), die elektrisch aufgeheizt wird => Elektronen werden emittiert • Die Elektronen werden in einem elektrischen Feld zur Anode hin beschleunigt • Im TEM dienen Magnetlinsen zur Formung des Elektronenstrahls. • Zwei Kondensorlinsen fokussieren den Strahl auf das Objekt • Eine Blende in der Objektivlinse be- grenzt den Strahl, indem sie stark ge- streute Elektronen ausblendet Quelle: http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/TEM.html

7. Grundlagen • Zwischen- und Projektivlinsen weiten den Strahl auf => hohe Endvergrößerung • Das von den Elektronen projizierte Bild kann nicht direkt wahrgenommen werden • Daher verwendet man einen fluoreszierenden Leuchtschirm, der beim Aufprall von Elektronen sichtbares Licht emittiert. • Vergrößerungen von ca. 100-fach bis ca. 800 000-fach sind einstellbar Quelle: http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/TEM.html

8. Grundlagen • Zur Analyse können entweder • die von der Objektoberfläche reflektierten Elektronen (=>REM) • oder die transmittierten Elektronen (=>TEM) herangezogen werden. Weitere Analysemöglichkeiten sind: • Elektronenbeugung zur Strukturbestimmung und • spektrale Auswertung von (durch die Elektronen angeregten) Röntgenstrahlen (EDX) zur Elementanalyse. Quelle: Skript zum Praktikum Instrumentelle Analytik (IAA 2000)

9. TEM - Voraussetzung • Die optimale Schnittdicke der Ultradünnschnitte liegt bei 60-70nm • Bei dieser Dicke können Elektronen den Schnitt passieren, gleichzeitig werden sie aber von den Strukturen im Schnitt stark genug gestreut, um ein Abbild erzeugen zu können. • Die Probendicke richtet sich nach • der Ordnungszahl der Atome, aus denen die Probe besteht • der Höhe der Beschleunigungsspannung • der gewünschten Auflösung • Im TEM muss ein hohes Vakuum erzeugt werden => keine WW von Elektronen mit Gasmolekülen => Vorbereiten der Proben nötig (Kontrastierung mit Schwermetallen und/oder Entwässerung)

10. TEM - Voraussetzung • De Broglie-Beziehung:  = h /p • Erinnerung: Schnelle Elektronen haben eine sehr viel kleinere Wellenlänge als sichtbares Licht • =>höhere Beschleunigungsspannung => kleinere Wellenlänge => größerer Impuls => bessere Auflösung • Je höher die Ordnungszahl und je niedriger die Be- schleunigungsspannung sind, desto dünner muss die Probe sein.

11. TEM – Vorbereiten der Probe • Für die Herstellung von Ultradünnschnitten werden besondere Mikrotome benötigt, an denen mit Glas- oder Diamantmessern geschnitten wird (Alternative: Schleifen oder Ionenbeschuss). • Die Schnitte werden auf kleine Kupferringe (Grids) aufgelegt, die mit einer hauchdünnen Folie bezogen sind. • Um die Elektronenbeugung und damit den Kontrast zu verstärken, können verschiedene Schwer- metallionen an die Schnitte gebunden werden (Kontrastierung). • Die Schwermetallionen binden an be- stimmte Molekülarten in den Schnitten, die dann im elektronenmikroskopischen Bild deutlich dunkler erscheinen. Quelle: http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/TEM.html

12. TEM - Nachteile • Die aufwändige Vorbereitung der Proben kann zu Artefakten führen => Strukturen, die nichts mit dem eigentlichen Objekt zu tun haben und die Auswertung der Bilder erschweren können. • Ein weiteres Problem ist die Schädigung der Proben durch • den Elektronenstrahl z.B. durch Erwärmung oder Wegstoßen ganzer Atome nach Kollision mit den schnellen Elektronen • Einschluss von Fremdatomen aus dem Vakuum in die Probe. • Da die Proben im Vakuum betrachtet werden müssen, kann kein lebendes Material untersucht werden. • Die Technik ist aber schon soweit gereift, dass es möglich ist, feuchte Proben bzw. nicht vorbehandeltes Material im REM zu betrachten (sog. Environmental Scanning Electron Microscopes, ESEM). • Elektronenmikroskope, insbesondere TEMs, sind außerdem sehr teuer in Anschaffung und Unterhalt.

13. Bei der Rasterelektronenmikroskopie wird der Elektronenstrahl zu einem möglichst kleinen Fleck auf die Probe fokussiert. Dieser wird nun in kleinen Schritten über die Oberfläche des Untersuch-ungsobjektes gerastert. Trifft er auf die Probe auf, werden einige Elektronen reflektiert, andere dringen in die Oberfläche ein und verursachen durch ihre hohe Energie die Emission weiterer Elektronen(=> Sekundärelektronen) Die reflektierten und emittierten Elektronen werden durch Elektromagnete gebündelt und auf einen Detektor geleitet. Je nach Lage des getroffenen Punktes werden unterschiedlich viele und unterschiedlich energiereiche Elektronen vom Detektor erfasst. Aus den für jeden einzelnen Punkt detektierten Werten wird dann das Gesamtbild zusammengesetzt. REMBorsten von Branchiomma bombyx 1

14. EDX (Energy Dispersive X-ray Analysis) • Häufigste eingesetzte Methode zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Zusammensetzung einer Probe. • Die Atome des Probenmaterials werden infolge der WW mit den Elektronen zur Emission von Röntgenstrahlung anregt. • Hintergrund: => Atome unterschiedlicher chemischer Elemente emittieren Röntgenstrahlung unterschiedlicher, charakteristischer Energie. • Die Auswertung erfolgt über die von einem Detektor gemessenen Röntgenspektren. • Das Verfahren bietet eine sehr hohe Ortsauflösung, da die spek-troskopische Information aus einem sehr kleinen Probenvolumen in der Größenordnung von wenigen Mikrometern stammt.

15. EDX- Vorteile • In Kombination mit REM können mit den EDX System auch Elementverteilungen entlang einer Linie (Line Scan) oder innerhalb eines größeren Probenbereiches (Mapping) analysiert werden. • Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass alle in der Probe enthaltenen Elemente von der Ordnungszahl 5 (Bor) bis 92 (Uran) simultan detektiert und analysiert werden können. • Besonders breite Anwendung findet sie in • der metallverarbeitenden Industrie, • bei der Untersuchung von Glas, Keramik & Baustoffen, • sowie bei der Analyse von Schmierstoffen und Mineralölprodukten. • Die Nachweisgrenze liegt etwa bei einem Mikrogramm pro Gramm. Quelle: http://www.rontec.com/index.php?id=71

16. EDX- Detektor • Der Detektor misst die Energie jedes eintreffenden Röntgenphotons. • Wird ein Röntgenphoton im sensitiven Bereich des Detektors absorbiert, so entstehen dort Elektron-Loch-Paare, deren Anzahl proportional zur Energie des Photons ist. • Es existieren zwei wichtige Detektorvarianten: • Si(Li)-Detektor • Siliziumdriftdetektor (SDD)

17. EELS (Electron energy-loss spectroscopy) • Wird eine sehr dünne Probe mit einem Strahl hochenergetischer Elektronen bestrahlt, so wird ein Großteil der Elektronen die Probe ungehindert durchdringen, ein Teil jedoch mit der Probe wechsel-wirken. • Je nach Wechselwirkung ändern die Elektronen nur ihre Richtung (elastische Streuung) oder aber Richtung und Geschwindigkeit (inelastische Streuung). • Der Energieverlust inelastisch gestreuter Elektronen ist charakteristisch für bestimmte Wechselwirkungen, etwa die Ionisierung eines Atoms. • Bei der EELS wird lediglich die Anzahl der Elektronen mit einem bestimmten Energieverlust gezählt. • Die Elemente können anschließend anhand typischer Intensitäts-verläufe (etwa einer Ionisations-Kante) identifiziert werden.

18. EFTEM (Energy Filtered Transmission Electron Microscopy) • Bei EFTEM werden nur Elektronen bestimmter Bewegungsenergie zur Bilderzeugung zugelassen => ein Ausschnitt des EELS-Spektrums. • Die Elektronen werden nach ihrer Energie gefiltert. • Hierbei werden die Elektronen durch ein Magnetfeld auf unter-schiedliche, von ihrer Geschwindigkeit abhängige, Flugbahnen gelenkt. • Anschließend erlaubt eine bewegliche Blende nur bestimmte Flugbahnen und selektiert somit bestimmte Bewegungsenergien.

19. EFTEM(Energy Filtered Transmission Electron Microscopy) • Die Bildintensität kann dann mit einem bestimmten WW-Prozess in Verbindung gebracht werden => Verteilung von Elementen in der Probe wird in einem Bild sichtbar • Dazu werden im einfachsten Fall zwei Bilder aufgenommen: • ein Bild mit Elektronen deren Energieverlust genau der Ionisationsenergie eines bestimmten Elements entspricht • ein Bild mit einem Energieverlust unmittelbar vor der Ionisationskante. • Eine Division dieser beiden Bilder ("Kante : Vorkante") zeigt jene Bildstellen hell, an denen das Element verstärkt vorhanden ist.

20. Quelle: A. Berendes, O. Brunkahl, C. Angelkort , W. Bock, F. Hofer, P. Warbichler, B. O. Kolbesen, Anal Bioanal Chem, 379, 2004, 554–567 Beispiel

21. Literatur 1 http://www.zoosyst-berlin.de/methoden/REM http://www.zoosyst-berlin.de http://james.physik.uni-freiburg.de http://www.uni-kl.de/IFOS/verfahren/pdfs/tem.pdf http://www.didaktik.physik.uni-erlangen.de http://wikipedia.de http://www.physik.uni-augsburg.de http://www.biomedicalinnovation.de/deutsch/REM-EDX/rem-edx Einführung in die Elektronenmikroskopie, M. v. Heimendahl, vieweg, 1970 Electron Microskopy of Thin Crystals, P. B. Hirsch, A. Howie, R.B. Nicholson, D. W. Pashley, M. J. Whelan, Butterworths,1965 Surface an Thin Film Analysis, H. Bubert, H. Jenett, Wiley-VCH, 2002 CD Römpp Chemie Lexikon-Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995

22. Danke für die Aufmerksamkeit!

23. Anhang

24. Hellfeldabbildung • Bei der Hellfeldabbildung werden die un-gestreuten Strahlen zur Erzeugung des Kontrastes herangezogen. • Die stärker gestreuten Strahlen werden durch eine Blende ausgeblendet und erreichen nicht den Detektor. • Da die Streuung mit der Ordnungszahl Z zunimmt, nimmt die detektierte Elektronen-transmission in der Hellfeldmethode bei Elementen mit hohem Z ab. Quelle: M.Guder, Eigene Aufzeichnungen

25. Dunkelfeldabbildung • Bei der Dunkelfeldmethode wird die Blende so verschoben, bzw. der Elektronenstrahl so zur Probe gekippt, das die ungestreuten Strahlen ausgeblendet werden. • Somit erreichen nur die gestreute Elektronen den Detektor. • Da die Streuung mit der Ordnungszahl Z zu- nimmt, nimmt die detektierte Elektronen- transmission in der Dunkelfeldmethode bei Elementen mit hohem Z zu. Quelle: M.Guder, Eigene Aufzeichnungen

26. Daten für„Elmiskop I“ der Fa. Siemens AG • Beschleunigungspannung 40-60-80-100kV, wobei die Anode auf Erdpotential liegt • Kathodenheizung 2-3V • Elektronenstrom 0-60µA (regulierbar durch Hilfsspannung) • Vergrößerung durch das Objektiv allein 200fach • Vergrößerung durch Objektiv + Zwischenlinse 2600fach • Elektronenoptische Vergrößerung durch alle drei Linsen 8000 – 200.000fach (regulierbar durch variable Zwischenlinsen) • Abstand Kathode – Anode ca. 13mm • Objektivbrennweite 2.8mm • Mikroskoprohrlänge insg. 1.25m • Vakuum 10-4 – 10-5 Torr (Objektraum und Plattenkammer jeweils durch Schleusen abtrennbar => schneller Proben- bzw. Plattenwechsel) • Beschleunigungsspannung von 100kV => je nach Atomgewicht der Proben von 50 – 300nm durchstrahlbar

27. EDX-Detektoren Si(Li)-Detektor: • Ein Si(Li)-Detektor besteht aus einem zylindrischer Siliziumkristall mit 3 mm bis 5 mm Dicke. • Die Röntgenphotonen werden in dem mit Lithium gedrifteten, zentralen Bereich des Kristalls absorbiert. • Die notwendige Kühlung von Si(Li)-Kristall und Teilen des Vorverstärkers erfolgt meist mit Hilfe von flüssigem Stickstoff. • Der dafür verwendete Stickstoff-Kryostat ist mit einem dünnen Strahleneintrittsfenster (meist aus Beryllium) versehen, welches den empfindlichen Detektorbereich von der Umgebungs-atmosphäre trennt und eine gute Transmission für die interessierende Strahlung zu gewährleisten hat.

28. EDX-Detektoren Siliziumdriftdetektoren (SDD): • SDDs werden aus meist 0.3 -0.5mm dicken Si-Wafern hergestellt. • Die (volumenabhängigen) Leckströme sind deutlich geringer, was das Rauschen des Ausgangssignals verkleinert. Deshalb genügt es, sie auf etwa -20°C zu kühlen. • Dadurch (und wegen der effizienteren Herstellung auf Wafern) sind sie kleiner und günstiger als Si(Li)-Detektoren. • Da die elektrischen Signale in der Mitte des Siliziumdriftdetektors auf einer kleinen Anode gesammelt werden, ist ihre Elektrische Kapazität geringer als bei Si(Li)s, was eine um den Faktor 10 schnellere Messzeit erlaubt. • Deshalb lösen sie zunehmend Si(Li)-Detektoren ab.

29. Entwässern Chemischer Weg: • Fixierung des Gewebes durch Glutaraldehyd/ Paraformaldehyd • Entwässerung durch Aceton/Ethanol und Einbettung in Harz. • Bei der Elektronenmikroskopie ist jedoch eine besonders gute Gewebserhaltung entscheidend • Ebenso sollen auch Strukturen im Submikrometer-Bereich im fixierten Präparat erhalten bleiben • Kältefixierung Quelle: http://www.zoologie-skript.de/methoden/bioprobe/cutem.htm

30. Entwässern Kältefixierung 1. Tauchen der frischen Bioprobe in flüssiges Propan, das in einem Bad von flüssigem Stickstoff (-190°C) gekühlt wird. • Probe wird schlagartig gefroren (Abkühlung: 105 – 106 Kelvin/sec) • Somit Verhinderung von Eiskristallen im Gewebe und damit die Zerstörung von subzellulären Strukturen. 2. Das kältefixierte Präparat wird bei etwa -80°C entwässert. => Gewebewasser wird durch Aceton ersetzt (Gefrier-substitution) oder im Vakuum verdunstet (Gefrier-trocknung). 3. Das entwässerte Präparat kann dann in Harz eingebettet, getrimmt und geschnitten werden. Quelle: http://www.zoologie-skript.de/methoden/bioprobe/cutem.htm