พันธุวิศวกรรมศาสตร์

1. พันธุวิศวกรรมศาสตร์ Genetics Engineering โดย นางสาวฐาปนี เสริมสุธีอนุวัฒน์

2. พันธุวิศวกรรมศาสตร์ วิศวกรรมพันธุศาสตร์ Genetic engineering การตัดต่อ ดัดแปลง เพิ่มจำนวน สารพันธุกรรม เทคโนโลยีชีวภาพ สาขาหนึ่ง ระดับโมเลกุล(molecular biology) ระดับนาโน(nanotechnology)

3. การปรับปรุงพันธุ์พืช • - Tissue culture • Gene technology • ดัดแปลงลักษณะที่เอื้อต่อผู้ผลิต • ดัดแปลงลักษณะที่เอื้อต่อผู้บริโภค Biotechnology Biotechnologyหรือ เทคโนโลยีชีวภาพ คำจำกัดความ.. ด้านการเกษตร อุตสาหกรรม การแพทย์ ฯลฯ

4. Why genetic engineering ? การพัฒนาพันธุ์แบบดั้งเดิม ผสมพันธุ์ และ คัดเลือก เพื่อวัตถุประสงค์เฉพาะ ความหลากหลายทางพันธุกรรม วิวัฒนาการ นักผสมพันธุ์

5. ข้อจำกัดของการผสมพันธุ์ข้อจำกัดของการผสมพันธุ์ - ความหลากหลายทางพันธุกรรมไม่เพียงพอ ไม่มีลักษณะที่ต้องการ (limited gene pool) - ความห่างทางพันธุกรรม ไม่สามารถผสมข้ามได้ - ใช้ระยะเวลานานในการคัดเลือกพันธุ์ Mutation & Gene Technology เทคนิคช่วยเสริม หรือ ลดข้อจำกัดลง

6. Gene/DNA cloning Clone: breeding = tissue culture = genetic engineering = Cloning: การเพิ่มปริมาณยีน หรือ ดีเอ็นเอ ที่ต้องการ เพื่อใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรมและอื่นๆ องค์ประกอบสำคัญ: ดีเอ็นเอที่ตัองการโคลน ดีเอ็นเอพาหะ(cloning vector, DNA vector) เซลล์เจ้าบ้าน(host cell)

7. ดีเอ็นเอในจีโนม(Genomic DNA) ปริมาณมาก ประกอบด้วย ส่วนที่เป็นยีน และ ไม่ใช่ยีน แบ่งจีโนมให้มีขนาดเล็กลง (ตัดดีเอ็นเอให้สั้นลง) ก่อนการเพิ่มปริมาณ

8. ขั้นตอนโดยทั่วไปในการทำโคลนนิ่งขั้นตอนโดยทั่วไปในการทำโคลนนิ่ง เตรียมดีเอ็นเอที่ต้องการโคลน (ตัดด้วยเอนไซม์ หรือ เพิ่มปริมาณด้วยปฏิกิริยาจำเพาะ) เตรียมเวคเตอร์ ต่อดีเอ็นเอที่ต้องการ เข้ากับ ดีเอ็นเอเวคเตอร์ ถ่ายย้ายเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน

9. ขั้นตอนโดยทั่วไปในการทำโคลนนิ่งขั้นตอนโดยทั่วไปในการทำโคลนนิ่ง คัดเลือกเซลล์ที่มีดีเอ็นเอที่ต้องการ เพิ่มปริมาณเซลล์ที่คัดเลือก สกัดแยกดีเอ็นเอที่ต้องการ นำไปใช้งานต่อไป

11. DNA vector ดีเอ็นเอที่มีคุณสมบัติจำเพาะ จาก แบคทีเรีย ไวรัส ยีสต์ หรือ สร้างขึ้น (artificial chromosome) นำดีเอ็นเอแปลกปลอมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน (แบคทีเรีย หรือ ยีสต์) เพื่อการจำลองตัว เป็นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ

12. คุณสมบัติของเวคเตอร์ • - มี multiple cloning region, MCR • multiple cloning site, MCS • เพื่อนำดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณเข้าไปแทรก • มี origin of replication, ORI • เพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในเซลล์เจ้าบ้าน • มีselectable marker**ให้ฟีโนไทป์ใหม่ • เพิ่อการคัดเลือกเซลล์เจ้าบ้านที่มีดีเอ็นเอแปลกปลอม **นำไปสู่ข้อขัดแย้งเกี่ยวกับพืชดัดแปลงพันธุกรรมในยุคแรกๆ

13. ชนิดของเวคเตอร์ plasmid bacteriophage cosmids phagemid bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC)

14. Plasmid ดีเอ็นเอขนาดเล็กในแบคทีเรีย แยกเป็นอิสระจากโครโมโซมหลัก bacterial DNA = chromosomal DNA plasmid DNA รูปวงกลม ขนาด 2000 – 200000 คู่เบส (2-200 kilobasepair, kbp)

15. Plasmid ขนาดของพลาสมิดในการทดลอง โดยทั่วไป ประมาณ 3-4 กิโลเบส รับดีเอ็นเอใหม่ (insert) ได้ถึง 10 กิโลเบส ใช้เป็นพาหะนำดีเอ็นเอขนาดเล็กเข้าสู่เซลล์

16. ข้อดีของพลาสมิดขนาดเล็กข้อดีของพลาสมิดขนาดเล็ก ถ่ายย้าย เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านได้ง่าย พบตำแหน่งตัดด้วยเอนไซม์ ไม่ซ้ำซ้อนมาก unique sites for restriction enzyme การเพิ่มจำนวนทำได้เร็ว

18. pBR322 plasmid

19. Selectable marker Ampicillin resistance gene ori MCS

20. Bacteriophage พบในไวรัส โครงสร้างเป็นเส้นตรง หรือวงกลม ดีเอ็นเอเส้นคู่ เส้นเดี่ยวหรืออาร์เอ็นเอเส้นเดี่ยว มีประสิทธิภาพมากกว่าพลาสมิด ในการนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านอีโคไล รับดีเอ็นเอขนาดใหญ่เมื่อเทียบกับพลาสมิด เช่น bacteriophage lambda

21. โครงสร้างประกอบด้วย ส่วนที่เป็น head และtail โปรตีนห่อหุ้ม สารพันธุกรรม

22. Bacteriophage lambda

23. วงจรชีวิตของเฝจแลมบ์ดาวงจรชีวิตของเฝจแลมบ์ดา lysogenic cycle ดีเอ็นเอแทรกในโครโมโซมเจ้าบ้าน lytic cycle ดีเอ็นเอเป็นอิสระ สร้างไวรัสโมเลกุลใหม่ เซลล์เจ้าบ้านแตก

24. Phage lambda life cycle

25. Host cell หรือ เซลล์เจ้าบ้าน เซลล์รับดีเอ็นเอเพื่อการเพิ่มปริมาณ หรือตรวจสอบคุณสมบัติ การแสดงออกของยีน เซลล์เจ้าบ้านที่ดีต้องมีประสิทธิภาพในการรับดีเอ็นเอ เรียกว่า competent cell ตัวอย่าง เช่น แบคทีเรีย E. coli

26. Digestion การตัด หรือ ย่อย ดีเอ็นเอที่ตำแหน่งเฉพาะ ด้วยเอนไซม์ ตัดจำเพาะ restriction endonuclease restriction nuclease restriction enzyme ในสภาวะที่เหมาะสม อุณหภูมิ บัฟเฟอร์ ความเข้มข้นของเกลือ

27. Restriction enzyme Recognition site ตำแหน่งจดจำบนดีเอ็นเอ ความยาว 4-8 เบส ลำดับเบสเหมือนกันบนดีเอ็นเอทั้ง 2เส้น 5’ NNGAATTCNN 3’ 3’ NNCTTAAGNN 5’ ตัด/ย่อย phosphodiester bond ระหว่างเบส ที่ตำแหน่งเดียวกันบนดีเอ็นเอทั้ง 2 เส้น

28. ปลายของดีเอ็นเอที่ได้หลังการตัดปลายของดีเอ็นเอที่ได้หลังการตัด Restriction end blunt end ปลายทู่ sticky endปลายเหนียว 5’ sticky end 3’ sticky end

29. ตำแหน่งจดจำ ตัดระหว่าง G & A 5’ sticky end การตัดดีเอ็นเอด้วย เอนไซม์ EcoRI

32. Ligation การต่อดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล โดยนิวคลีโอไทด์ที่จะต่อได้ ต้องมีปลาย 3’ OH และ5’ P เอนไซม์ไลเกส (ligase)ทำหน้าที่ เชื่อม phosphodiester bondระหว่าง 2 nt cofactor: ATP, NAD เช่น T4 ligase, T7 ligase, E. coli ligase

33. Ligation of Sticky Ends ดีเอ็นเอเส้นคู่เชื่อมกันด้วยพันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบส (complementary bases) เอนไซม์ไลเกสเชื่อมพันธะระหว่างเบส บนดีเอ็นเอเส้นเดียวกัน

34. Sticky end ต่อง่ายกว่า มีพันธะ H เชื่อมโมเลกุล Blunt end ต่อยากกว่า เชื่อม 2 จุดพร้อมกัน

35. DNA insert plasmid religated plasmid recombinant DNA

36. Transformation การนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน Transformation Transgene Transformed cell Transformant Transgenic organisms Genetically Modified Organisms, GMOs Transgenic plant GM plant

37. Transformation การนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย กระตุ้นด้วยความร้อน heat shock กระตุ้นด้วยกระแสไฟฟ้า electroporation เยื่อหุ้มเซลล์เกิดช่องว่างชั่วคราว เป็นทางผ่านของดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์

38. Selection การคัดเลือกเซลล์ที่เป็นtransformant ใช้ฟีโนไทป์ที่ได้จากเวคเตอร์ (selectable marker) เลี้ยงแบคทีเรียบนอาหารเลี้ยงเชื้อ นำโคโลนีที่เจริญ ไปเพิ่มปริมาณต่อไป

39. Bacterial transformation

40. Bacterial transformation

41. Transgenic bacteria เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (replication) ใช้เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีน เป็นแหล่งผลิตโปรตีน เช่น ฮอร์โมน หรือ ยา (transcription / translation)