optymalizcja

1. optymalizcja PCR

2. W połowie lat 80 opracowano technikę, służącą do amplifikacji (powielania) dowolnej sekwencji DNA z użyciem pary oligonukleotydowych starterów oraz termostabilnej polimerazy DNA. PCR przeprowadza się całkowicie in vitro, bez wykorzystania komórek. -łańcuchowa reakcja polimerazy (polymerare chain reaction) PCR

3. CYKLE REAKCJI PCR • Denaturacja dwuniciowego DNA w 95oC • Przyłączenie startera do matrycy w temperaturze ok.55oC • Polimeryzacja w 72oC

4. STANDARDOWE KOMPONENTY REAKCJI PCR • Matryca DNA lub RNA • Startery • Bufor • Substraty-dNTP • Jony Mg2+ • Termostabilna polimeraza DNA

5. STANDARDOWA MIESZANINA REAKCYJNA

6. OPTYMALIZACJA PCR • Reakcja PCR nie przebiega zwykle ze 100% wydajnością • W celu zwiększenia wydajności należy odpowiednio zmieniać warunki reakcji • Optymalizacja jest bardzo ważna w przypadku amplifikowania docelowej sekwencji występującej w populacji z innymi sekwencjami

7. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE EFEKTYWNOŚĆ REAKCJI PCR NA • Wyposażenie:typ próbówki, typ termocyklera • Ilość cykli, temperatura i czas termicznego cyklu • Objętość próbówki reakcyjnej • Próbka DNA (ilość, czystość)

8. PARAMETRY ULEGAJĄCE ZMIANOM W REAKCJI PCR • Stężenie matrycy • Temperatura przyłączania starterów • Stężenie MgCl2 • Stężenie dNTP • Stężenie polimerazy Tag

9. TEMPERATURA PRZYŁĄCZANIA STARTERÓW • Punkt wyjścia – temperatura dysocjacji dupleksu starter – matryca oznaczona jako temperatura topnienia ( Tm ) • Najlepsze rezultaty – startery, których Tm jest równe lub wyższe niż 54oC • Starter krótszy niż 25 nukleotydów – Tm oblicza się z poniższego wzoru: Tm=4(G + C) + 2( A + T)

10. TEMPERATURA PRZYŁĄCZANIA STARTERÓW • Długość startera większa niż 25 nukleotydów – Tm oblicza się używając specjalistycznego programu komputerowego. • Im dłuższe startery tym większa temperatura topnienia ( łatwiejsza praca ) • Wraz z obniżeniem temperatury maleje specyficzność.

11. TEMPERATURA PRZYŁĄCZANIA STARTERÓW • Tm startera w porównaniu z Tm matrycy nie powinna być zbyt niska • Tm startera zależy od jego długości i sekwencji • Im więcej GC tym wyższa wartość Tm • Zbyt niska temperatura Tm faworyzuje niewłaściwe łączenie nukleotydów w pary • Długość startera ma wpływ na jego swoistość

12. TEMPERATURA PRZYŁĄCZANIA STARTERÓW Tm uzyskuje się przez obniżenie w każdym kolejnym cyklu temperaturę hybrydyzacji zaczynając od stopni powyżej Tm a kończąc do 10 oC poniżej Tm.

13. STĘŻENIE MATRYCY • Ilość matrycowego DNA mieści się w zakresie: • Plazmidowy lub fagowy DNA 0,01-1 ng • Genomowy DNA 0,1-1 g • Większa ilość matrycowego DNA, zwiększa zawartość niespecyficznych produktów PCR

14. STĘŻENIE MgCl • Waha się od 1-4 mM • Podwyższając stężenie nukleotydów należy zwiększać stężenie jonów Mg2+ • Nukleotydy redukują pulę wolnych jonów Mg2+ wpływając w ten sposób na aktywność polimerazy i hybrydyzację starterów • Za dużo jonów Mg2+ – zwiększa zawartość niespecyficznych produktów PCR i obniża wierność (zgodność ) syntezy • Jeżeli próbka DNA zawiera EDTA zawartość jonów Mg2+ powinna proporcjonalnie wzrosnąć

15. STĘŻENIE dNTP • W mieszaninie reakcyjnej każdego dNTP zwykle po 200 M • Nierówna ilość dNTP redukuje wydajność amlifikacji • Optymalne stężenie dNTP zależy od: • Długości amplifikowanego produktu • Stężenia MgCl2 • Stężenia starterów

16. POLIMERAZA Tag • W 100 l mieszaniny reakcyjnej zwykle używa się 2-3 u • Wyższe stężenie – synteza niespecyficznych produktów • Jeżeli w mieszaninie reakcyjnej obecne są inhibitory (np. probówka DNA nie jest dobrze oczyszczona) większa ilość polimerazy Tag – 4-5 u jest pomocna w otrzymaniu lepszej zawartości produktów amlifikacji

17. BUFOR Mieszanina poza buforem Tris o ph 8, często zawiera różne dodatki takie jak: BSA, siarczan amonu, Triton. Te dodatki mogą stabilizować polimerazę oraz modyfikować oddziaływania między matrycą i starterami.

18. OPTYMALIZACJA PCR Jeżeli przebieg reakcji nie jest optymalny to podczas badania produktów, często zamiast zdefiniowanego prążka w żelu pojawia się raczej rozciągnięta plama (ang. smear) mieszaniny rozmaitych produktów

19. JAK ZAPOBIEC NIESPECYFICZNEJ AMPLIFIKACJI • Użycie dobrze oczyszczonej matrycy w odp. stężeniu • Stować startery o wysokich Tm (powyżej 60oC) • Tm powinny być takie same albo bardzo zbliżone dla obu starterów • Dobrze dobrać stężenie Mg2+ • Nie stosować nadmiaru Tag polimerazy • Stabilizować enzym przez dodanie żelatyny, gdy denaturacja jest długotrwała

20. JAK ZAPOBIEGAĆ NIESPECYFICZNEJ AMPLIFIKACJI • Stosować DMSO-możliwość uzyskania przewagi długich produktów nad krótkimi • Unikać dużych stężeń EDTA w buforze w którym jest zawieszona matryca • Unikać pracy z termocyklerem różnych firm w tym samym laboratorium • Dobrze dobrać temperaturę przyłączania starterów