分子生物学

1. 分子生物学 第六章分子生物学研究法（下） ——基因功能研究技术 第一节基因表达研究技术 第二节基因敲除技术

2. 2 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

3. 3 转录组 广义 所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA 的总和 狭义 所有mRNA的总和 组学下的中心法则 基因组——转录组——蛋白质组

4. 4 转录组的研究 研究思路 特定条件下，细胞内mRNA丰度描述基因表达 水平 外推到蛋白质产物的丰度 研究的基本方法 基因芯片技术 转录组测序技术

5. 5 转录组测序方法：EST 表达序列标签技术 Expressedsequencetag,EST EST数据目前最多，但测序通量小，测序成本 高，不能得到基因表达丰度的信息

6. 6 转录组测序方法：SAGE 基因表达系列分析技术Serialanalysisof expression,SAGE 获得短的序列标签(10-14bp)，确定转录信息 将短序列标签有序连接起来，克隆 定量测定标签的数量，从而得到其表达水平

7. 7 SAGE

8. 8 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

9. 9 RNA的选择性剪接技术 用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生 不同的mRNA剪接异构体的过程 分类 平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、 外显子遗漏性剪接、相互排斥性剪接 研究方法 RT-PCR（real-timePCR）

10. 10 RNA的不同选择性剪接方式 平衡剪接 5’选择性剪切 3’选择性剪切 外显子遗漏性剪切 相互排斥性剪切

11. 11 RNA选择性剪接的研究方法：RT-PCR 不同组织来 源的RNA反转录 成cDNA 用相同引物进 行PCR 观察PCR产物 差异 分析是否来 源于选择性剪接

12. 12 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

13. 13 原位杂交技术（insituhybridization,ISH） 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放 射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色 体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种 手段 分类 RNA原位杂交 染色体原位杂交

14. 14 RNA原位杂交 用放射性或非放射性标记的特异性探针与 被固定的组织切片反应 若细胞中存在与探针互补的mRNA分子， 两者杂交产生双链RNA，通过检测放射性标 记或者酶促免疫反应显色，对该基因的表达 产物在细胞水平上进行定性定量分析

15. 15 RNA原位杂交 http://www.isogen-lifescience.com/uploads/iu/_5/iu_5xHGQvy-2tpZPukJKtA/ViewRNA-ISH-Tissue2.jpg

16. 16 染色体原位杂交：荧光原位杂交 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然 后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合 再通过与荧光素分子偶联的单克隆抗体来 确定DNA在染色体上的位置 优点 不需放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度 高，可同时观察几个DNA探针的定位

17. 17 http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/11540248

18. 18 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

19. 19 基因定点突变技术(site-directedmutagenesis) 改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编 码的氨基酸序列 研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结 构、催化活性以及结合配体能力的影响 改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载 体，引入新的酶切位点 目前无法精确预测氨基酸残基变化对整个 蛋白质结构和活性的影响

20. 20 基因定点突变的方法 两种PCR方法 重叠延伸技术 大引物诱变法

21. 21 重叠延伸技术：1/2 模板DNA5’ 3’ 3’ 5’ 引物变性和退火 FM RM F2 3’ 5’ 3’ 5’ R2 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR1 PCR2 重叠延伸、PCR3 5’ 3’ 3’ 5’

22. 22 重叠延伸技术:2/2 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR4

23. 23 大引物诱变法 5’ 3’ 3’ 5’ R1 M PCR1 5’ 3’ 3’ 5’ 大引物 大引物和野生型DNA分子混合，退火 5’ 3’ 5’ 3’ X 3’ 5’ 5’ 3’ PCR2 F2 5’ 3’ 3’ 5’

24. 24 PCR介导的定点突变的优点 突变体回收率高，有时不需进行突变体筛 选 能用双链DNA作为模板，可以在任何位点 引入突变 可在同一试管中完成所有反应 快速简便，无需在噬菌体M13上进行分子 克隆

25. 25 目录 基因表达研究技术 基因敲除技术 基本原理 高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术

26. 26 基本原理 又称基因打靶，通过外源DNA与染色体 DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰 和基因改造，具有专一性强，染色体DNA可 与目的片段共同稳定遗传等特点 1985年成功将外源质粒p∆β117插入到人 类染色体DNAβ-珠蛋白位点，首次在哺乳动 物细胞中进行成功的基因打靶

27. 27 基因敲除技术的基本原理 分类 完全基因敲除 完全消除细胞或动物个体的靶基因活性 条件型基因敲除（不完全基因敲除） 特定时间和空间的基因敲除

28. 30 完全基因敲除：正负双向选择原理(PNS) 正向选择基因neo插入或置换靶基因； 负向选择基因HSV-tk置于目的基因外侧， 含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上 生长，负向选择基因如果被随机重组到基因 组中会导致细胞死亡

29. 28 正向选择基因neo插入或置换靶基因 neo 6 9 6 9 neo 1 23 45 6789 1 23 45 9 HPRT+ HPRT+ 678 序列置换 序列插入 1 23 45 67neo9 HPRT+G418r HPRT+G418r

30. 29 目的基因 基因敲除载体 启动子1 2 3 4 HSV-tk 1neor12 3HSV-tk 同源重组 1 2 3 4 含有neor基因 的细胞能对抗抗生 素G418，不含有 HSK-tk基因的细 胞能对抗嘌呤类似 物丙氧鸟苷 HSV-tk 启动子 1neor123HSV-tk 抗生素G418，丙氧鸟苷 1neor1234 目的基因的第一个外显子被neor基因替换

31. 31 条件型基因敲除 Neo加入到靶基因的内含子中，并在靶基因两侧内含子中插入LoxP位点

32. 32 目录 基因表达研究技术 基因敲除技术 基本原理 高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术

33. 33 真核生物基因敲除的技术路线 构建重组基因载体 将重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外 源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组 重组载体中的DNA整合到内源基因组中， 并加以表达

34. 34 高等动物基因敲除技术 目的 基因 tk 4a 1 neo 2 棕色小鼠 4a同源重组 4b非同源重组 4c未重组 3 4b 4c 5a代替野生型基因 5b随机插入 5c没有插入 6a含插入基因的细胞 6b含随机插入的细胞 6c不含插入的细胞 7收集细胞 8用抗生素G418和 丙氧鸟苷处理 5b 6b 7 8 5a 6a 5c 6c

35. 35 在正常胚胎中植入 含插入基因的细胞 野生的雌性黑鼠 杂合子 将胚胎植入待孕黑色母体 新生的雄性嵌合鼠（棕色-黑色） 成熟的雄性嵌合鼠（棕色-黑色） 杂合子 纯合子，用于研究

36. 36 基因捕获法 要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型， 至少需要两代以上的遗传 基因捕获法也可以破坏靶基因表达 基因捕获载体包括一个无启动子的报告基 因，通常是neo基因

37. 37 基因捕获法 SAβgeo,无启动子 基因捕获载体 随机整合 内含子1 SAβgeo 外显子1 外显子1 外显子2 外显子2 随机插入内含子或外显子中 转录 剪切 翻译 5’ 5’

38. 38 目录 基因表达研究技术 基因敲除技术 基本原理 高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术

39. 39 植物基因敲除技术 由于动植物细胞结构显著不同，植物细胞 基因敲除采用不同于动物基因敲除的方法 T-DNA插入失活技术是植物中使用最广泛 的基因敲除方法

40. 40 T-DNA插入失活 利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化 将一段带有报告基因的DNA序列标签整合 到基因组DNA上 如果这段DNA插入到目的基因内部或附近， 就会影响基因的表达，从而使该基因失活。

41. 41 LB LP LP RP RP 野生型杂合型纯合型 将靶基因两端的引物LP,RP及插入 载体上的引物LB加入同一反应体系 中进行PCR

42. 42 小结 基因的分析技术 SAGE,RNA选择性剪接，原位杂交，基因定点 突变 基因敲除 正负双向筛选原理 条件型基因消除

43. 第六章分子生物学研究法（下） ——基因功能研究技术 第三节蛋白质及RNA相互作用技术 第四节基因芯片及数据分析

44. 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

45. 酵母单杂交系统 20世纪90年代中期发展起来的新技术 可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，用于 研究酵母细胞内DNA-蛋白质之间的相互作 用 通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作 用蛋白的编码基因 分析鉴定细胞中转录调控因子（一种蛋白 质）与顺式作用元件（一种DNA）相互作用

46. 酵母单杂交系统的基本原理 转录激活结构域AD 转录因子 顺式元件 顺式元件 顺式元件 最基本启动子 报告基因 结构 顺式元件在启动子上游，报告基因在启动子下游 过程 转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子，使报告 基因表达 接入三个以上的顺式作用元件，可增强转录因子的 识别和结合效率

47. 酵母单杂交系统的应用 确定某个DNA分子与某个蛋白质之间的相 互作用 分离编码结合在顺式作用元件或其他DNA 位点的功能蛋白的编码基因 验证反式作用因子的DNA结合结构域 准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序 列

48. 酵母单杂交系统的应用 从拟南芥cDNA文库中筛选出能与DRE结合的转录调控因子 拟南芥cDNA插入片段 PADH1 GAL4AD TADH1 LEU2 转化 DRE DRE DRE 最基本启动子 LacZ DRE URA3 筛选 挑选阳性克隆 测序，进一步验证活性 阳性克隆

49. 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

50. 酵母双杂交系统 利用真核生物转录调控因子的组件式结构 特征 DNA结合结构域bindingdomain,BD 转录激活结构域activatingdomain,AD BD能与启动子结合，不能激活转录 BD和AD形成的杂合蛋白，能激活转录