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第 8 章 紫外可见吸光光度法 及分子荧光分析法

第 8 章 紫外可见吸光光度法 及分子荧光分析法. 8.1 吸光光度法的基本原理 8.2 光度分析的方法和仪器 8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度 8.4 显色反应与分析条件的选择 8.5 吸光光度法的应用 8.6 紫外可见分光光度法在有机 定性分析中的应用 8.7 分子荧光与分子磷光 分析法. 例 : 含 Fe 约 0.05% 的样品 , 称 0.2 g, 则 m (Fe)≈0.1 mg. 重量法 m (Fe 2 O 3 )≈0.14 mg, 称不准.

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第 8 章 紫外可见吸光光度法 及分子荧光分析法

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  1. 第8章 紫外可见吸光光度法及分子荧光分析法 8.1 吸光光度法的基本原理 8.2 光度分析的方法和仪器 8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度 8.4 显色反应与分析条件的选择 8.5 吸光光度法的应用 8.6 紫外可见分光光度法在有机 定性分析中的应用 8.7 分子荧光与分子磷光分析法

  2. 例: 含Fe约0.05%的样品, 称0.2 g, 则m(Fe)≈0.1 mg 重量法m(Fe2O3)≈0.14 mg, 称不准 容量法V(K2Cr2O7)≈0.02 mL, 测不准 光度法 结果0.048%～0.052%, 满足要求 化学分析与仪器分析方法比较 准确度高 化学分析：常量组分(>1%), Er : 0.1%～0.2% 依据化学反应, 使用玻璃仪器 仪器分析：微量组分(<1%), Er : 1%～5% 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器 灵敏度高

  3. 1. 光学分析法: 基于电磁辐射与物质的相互作用. 非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法） 光学分析法 （不以光的波长为特征讯号） （以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法） 分子光谱法UV/Vis,IR,MFS,MPS 光谱法 原子光谱法 AAS,AES, AFS 仪器分析方法分类 2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及其变化 3.色谱法:气相色谱, 液相色谱 4.质谱法、热分析法、放射化学法等

  4. 8.1 吸光光度法的基本原理 吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。 特点 • 灵敏度高：测定下限可达10-5～10 -6mol·L-1, 10-4%～10-5% • 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2～5％ （1～2％） • 操作简便快速 • 应用广泛

  5. 8.1.1 光的基本性质(电磁波的波粒二象性) 波动性 c －真空中光速 2.99792458×108m/s ~3.0 ×108m/s －波长，单位：m,cm,mm,m,nm,Å 1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10m  －频率，单位：赫芝(周)Hz 次/秒 n －折射率，真空中为1 • 光的传播速度:

  6. 电场向量 Y 磁场向量 X x Z 传播方向

  7. 微粒性 光量子，具有能量。 h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s －频率 E－光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1eV=1.602×10－19 J

  8. 真空中: 波粒二象性 结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低. 单色光：具有相同能量(相同波长)的光. 混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在 一起. 例如白光.

  9. 光学光谱区 50 m ~300 m 200nm ~380nm 10nm~200nm 380nm ~ 780nm 780 nm ~ 2.5 m 2.5 m ~ 50 m

  10. 8.1.2 物质对光的吸收与发射 物质分子内部3 种运动形式及其对应能级： 1. 电子相对于原子核的运动--电子能级; 单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反. 三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同. 2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动 --振动能级; 3. 分子本身绕其重心的转动--转动能级.

  11. 单重态 三重态 S2 紫外 T2 系间窜跃 S1 荧光 可见 T1 磷光 v3 振动能级 v2 Ee Ev v1 红外 r3 转动 Er r2 r1 S0 分子吸光与发光示意图

  12. 原子光谱：吸收、发射、荧光 线状光谱  带状光谱 I  光谱种类 分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱 黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光 连续光谱 

  13. 蓝绿 分子对光的吸收与吸收光谱 不同颜色的可见光波长及其互补光

  14. 525 545 350 1.0 MnO4- Cr2O72- 0.8 Absorbance 0.6 0.4 0.2 /nm 300 350 400 500 600 700 Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱

  15. 甲苯(262nm) 苯(254nm) A  230 250 270 苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱

  16. 不同物质吸收光谱的形状以及max 不同 ——定性分析的基础 • 同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax 不同 ——定量分析的基础

  17. 8.1.3 光吸收基本定律:朗伯-比尔定律 朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的,吸光物质的c 一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比. 比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的 ,液层厚度b一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.

  18. 朗伯-比尔定律 A=lg(I0/It)=kbc 意义: 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.

  19. I0 It 入射光 透过光 透光率(透射比）T（Transmittance） 吸光度A (Absorbance） A= lg(I0/It) = lg(1/T) = —lgT = Kbc

  20. 1.0 100 0.8 80 A A=kbc 0.6 60 T (%) 0.4 40 0.2 20 c 吸光度A、透射比T与浓度c的关系

  21. 当c的单位用g·L-1表示时，用a 表示， A＝a b c a的单位: L·g-1·cm-1 • 当c的单位用mol·L-1表示时，用 表示.  －摩尔吸光系数 Molar Absorptivity A＝ b c  的单位: L·mol-1·cm-1 当c的单位用g·100mL-1表示时，用 表示, A＝ bc， 叫做比吸光系数. K吸光系数Absorptivity

  22. 显示器 光源 0.00 检测器 参 比 0.10 b 0.20 2b 吸光度与光程的关系A = abc

  23. 显示器 0.00 光源 检测器 参 比 0.10 c 0.20 2c 吸光度与浓度的关系A = abc

  24. 显示器 0.00 光源 检测器 参 比 0.10 红 0.00 红 吸光度与波长的关系A = abc 蓝绿光 红光

  25. 朗伯-比尔定律的适用条件 1. 单色光 应选用max处或肩峰处测定. 2. 吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件(酸度、浓度、介质等). 3. 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强.

  26. A 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 Ax * 。 。 。 。 cx 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL) 朗伯-比尔定律的分析应用 溶液浓度的测定 A＝ b c 工作曲线法 (校准曲线)

  27. 8.1.4 吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + … +An 用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。

  28. 1.目视比色法 观察方向 c1 c2 c3 c4 空白 8.2 光度分析的方法和仪器 8.2.1 光度分析的几种方法 方便、灵敏，准确度差. 常用于限界分析.

  29. 2. 光电比色法 通过滤光片得一窄范围的光(几十nm) 光电比色计结构示意图

  30. 单色器 吸收池 光源 检测系统 3. 吸光光度法和分光光度计 通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光. 波长可调, 故选择性好, 准确度高. 分光光度计的基本组成

  31. 强度 氙灯（气体放电光源） 钨灯（热辐射光源） 氢灯 /nm 400 600 1000 800 分光光度计的主要部件 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源

  32. 氙灯 氢灯 钨灯

  33. 800 600 500 400 红 λ1 白光 紫 λ2 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 准直透镜 入射狭缝 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同. 玻璃350～3200nm, 石英185～4000 nm

  34. 平面透射光栅 透镜 光屏 M1 M2 出射狭缝 光栅衍射示意图 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。 • －平面透射光栅 • －反射光栅（广泛使用） • 波长范围宽, 色散均匀, • 分辨性能好, 使用方便.

  35. 吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池 • 检测器：利用光电效应，将光能转换成 • 电流讯号。 • 光电池，光电管，光电倍增管 • 检流计（指示器）： • 低档仪器：刻度显示 • 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录

  36. 硒光电池（Barrier-layer photocell） h 阴极Au，Ag 半导体 Se 阳极 适用于300-800 nm, 在500-600 nm范围最灵敏。

  37. h 光电管(Phototube) （片） 红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm

  38. 光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT) 160-700 nm 1个光子可产生106～107个电子

  39. 吸光光度法仪器主要差异比较

  40. 8.2.2 分光光度计的基本类型 1. 单光束分光光度计 可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图

  41. 反光镜 参比池 放大器 检测器 光源hv 栅镜 光子检测器 滤光片或 单色器 样品池 反光镜 扇形镜 扇形镜 正面图 透明部分 反光镜 2. 双光束分光光度计 双光束型可以消除光源强度变化的影响.

  42. 3. 其他类型分光光度计 多通道仪器（Multichannel Instruments） 光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管) photodiode arrays (PDAs) 同时测量200～820nm范围内的整个光谱, 比单个检测器快316倍,信噪比增加3161/2 倍. 纤维光度计 将光度计放入样品中, 原位测量. 对环境和过程监测非常重要.

  43. HP 8452A多通道二极管阵列分光光度计

  44. 纤维光度计示意图 镀铝反射镜

  45. 纤维光度计

  46. 习 题 8.1 ～ 8.4

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