第四章基因工程的质粒载体

第四章基因工程的质粒载体

载体通论 （一）基本概念载体：在基因工程中，用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。（二）分类克隆载体表达载体质粒载体噬菌体载体人工染色体按载体功能分按载体性质分

在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体；在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。常用基因工程载体有：细菌质粒(克隆)； λ噬菌体(克隆)；柯斯质粒(克隆)；穿梭质粒(克隆/表达)；细菌人工染色体(克隆/表达)；酵母人工染色体(克隆/表达)； Ti质粒及其衍生载体(转化)。

（三）基因工程载体必须具备的条件： ※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件

（四）基因工程中常用的载体 基因工程中常用的载体有5类：质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）

载体的种类和特征

第一节质粒载体 一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

大肠杆菌的质粒

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

1. 质粒的一般生物学特性 （1）分子小： 1—200 kb （2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。（3）环形状：双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。

（4）质粒的空间构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型　　

（5）质粒空间构型与电泳速率 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是L DNA和OC DNA OC L SC

2 质粒DNA的转移 （1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒: 能自我转移非接合型质粒不能自我转移

（1.1）接合型质粒 又叫自我转移型质粒。除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。

（2）F质粒(F plasmid) • 又称F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别并有转移能力的质粒。分子量约为大小94kb，共编码19个转移基因。 • F质粒在寄主细胞中有三种存在形式： • 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带来自寄主染色体的基因或DNA区段。 • 以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，携带着细菌的染色体基因或DNA区段。 • 以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上。

F质粒结构： tra区（转移区，与质粒转移和性菌毛合成有关） oriT（转移起始点） oriS复制起始点） inc（不相容群） rep（复制功能）转座因子

根据F质粒在细胞中的存在方式，可把大肠杆菌分成四种不同接合型菌株。根据F质粒在细胞中的存在方式，可把大肠杆菌分成四种不同接合型菌株。（1）F+菌株 F+菌株即“雄性”菌株，指细胞内存在一至几个F质粒，并在细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。（2）F-菌株 F-菌株即“雌性”菌株，指细胞中无F质粒、细胞表面也无性菌毛的菌株。

（3）Hfr菌株（高频重组菌株） 在Hfr菌株（高频重组菌株）细胞中，因质粒由游离态转为在核染色体组特定位点上的整合态，故Hfr菌株与F-菌株相接合后，发生基因重组的频率比单纯用F+与F-接合后的频率高出数百倍。（4）F’菌株当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒，称F’质粒或F’因子。

在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对，这种过程称为细菌的接合作用（conjunction）。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对，这种过程称为细菌的接合作用（conjunction）。 F因子DNA拷贝，需1分钟时间从雄性细胞转移到雌性细胞

（3）质粒DNA的接合转移①细胞交配对的形成 雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。　　大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的“表面排斥”蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。 ②质粒DNA的转移 F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口链在其游离的5′-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞。

2. 非接合型质粒： 虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。符合基因工程的安全要求。（1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。

（2）Col质粒： 带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。

3 质粒DNA的迁移作用 非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用（mobilization）。 ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1 DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因（mobilization gene）编码的核酸酶。

相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供其所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供其所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。（b）中的细胞同时含有F和ColE1两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为其DNA转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而在F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColE1的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证明，mob-突变是隐性的，mob基因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能发生缺口，因此仍然不能够转移。

4 质粒DNA的复制类型 根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，将质粒分为低拷贝数的质粒和高拷贝数的质粒 1.低拷贝数的质粒拷贝数少，只有1—3份拷贝，也称为“严紧型”复制控制的质粒（stringent plasmid） 2. 高拷贝的质粒拷贝数多，有10—60份拷贝，也称为“松弛型”复制控制的质粒（relaxed plasmid）（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。

质粒拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目。质粒拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目。质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型间存在一定的相关性。接合型质粒，分子量大，一般属严紧型非接合型质粒分子量小，一般属松弛型

5 质粒的不亲和性 （1）质粒的不亲和性现象所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒　　不亲和群（incompatibility group），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。

（2）质粒不亲和性的分子基础　　质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。　　大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制活动便被抑制；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续进行。　　由于每一种质粒的复制速率和拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。

同一细胞中含有两种不相容的质粒，其产生的阻遏蛋白质不仅调节自身的复制，也会调节另一种与之共存的不相容质粒的复制同一细胞中含有两种不相容的质粒，其产生的阻遏蛋白质不仅调节自身的复制，也会调节另一种与之共存的不相容质粒的复制

第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制 一．质粒DNA复制的多样性不同质粒DNA的复制在如下几个方面存多样性：（i）对寄生酶的依赖性有的完全利用寄主细胞所提供的核酸酶，有的自身也编码若干核酸酶，参加DNA复制（ii）DNA聚合酶的利用多数利用polIII, 有的质粒利用polI （iii）复制的方向性有纯单向的，纯双向的，有既有单向又又双向的（iv）复制的终止单向复制，在起点处终止复制双向复制，在复制叉到达同一位点时终止，或有一固定的终止位点（v）复制型蝶状复制

二．ColE1质粒DNA复制的启动 ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNAⅡ两种RNA分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。 RNAⅡ也叫做复制引物。RNAⅡ分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释放出3′-OH末端，作为供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。 RNAⅠ可以通过同RNAⅡ结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。从本质上讲，ColE1质粒的复制启动显然是受一种负反馈机理控制的。根据这种模型，细胞中RNAⅠ分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。例如，若细胞中质粒拷贝数下降到正常数值以下的水平，RNAⅠ的浓度也就相应降低，于是质粒的复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。

三．质粒复制控制的分子模型 质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model）：阻遏蛋白质的合成受负反馈（negative feedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。

（1）抑制蛋白质稀释模型 质粒DNA编码的抑制蛋白质同质粒DNA的复制起点（oir）结合细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径阻断起始蛋白质Rep的合成

（2）自体阻遏蛋白质模型 • 1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的 • Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。 • 自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平。 • 由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制 • 2. Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质 • 既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用 • 又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制

第三节质粒DNA的分离与纯化 应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA分子。通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解的，绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量的形式释放出来，这样便可以应用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到了比较清亮的裂解液。

一．氯化铯密度梯度离心法 在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。　　氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙锭（EtBr）的氯化铯（CsCl）溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会通过在碱基对之间的嵌入作用而结合成DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，例如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合相当大量的EtBr分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子， EtBr分子的结合数量相对较少。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。

线性的或开环的DNA分子，可结合相当大量的EtBr分子，密度低线性的或开环的DNA分子，可结合相当大量的EtBr分子，密度低共价闭合环状的质粒DNA（cccDNA）分子， EtBr分子的结合数量相对较少，密度高通过氯化铯密度梯度离心，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。

二．碱变性法 　根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。　　通过加热，在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。　　线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。

三．微量碱变性法 微量碱变性法具有简单快速、经济实惠的优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种分离纯化质粒DNA的方法第一步，取1.5毫升含有质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I[50mM葡萄糖，25Mm Tris-HCl（Ph8.0），10Mm EDTA，4～5mg溶菌酶/mL]重新悬浮。将反应混合物在室温下静置5分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH值有很大的依赖关系， TrisHCl缓冲体系和适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。第二步，加入200微升冰冷的溶液Ⅱ[0.2N NaOH, 1.0%SDS]，缓缓混匀后，置室温下5分钟。SDS的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的DNA。在高pH值（12.0～12.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的染色体DNA片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响。　

第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸钠，缓缓震荡10秒钟后，放置在冰浴中5分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸钠，缓缓震荡10秒钟后，放置在冰浴中5分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。第四步，将上述离心所得的主要是含有质粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒DNA。按照这种方法制备的质粒DNA，其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。

四．影响质粒DNA产量的因素 （1）寄主菌株的遗传背景　　大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA的重要条件之下。建议使用endA基因发生突变的（endA1）大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。

（2）质粒的拷贝数及分子大小　　细菌培养物中质粒DNA之理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出。（2）质粒的拷贝数及分子大小　　细菌培养物中质粒DNA之理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出。质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。

第四章 基因工程的质粒载体