综合化学实验 —— 配位化学和生物无机化学部分

1. 综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分 指导教师：毛宗万刘文婷黄华珍 cesmzw@mail.sysu.edu.cn 997160366@qq.com huanghzh@mail.sysu.edu.cn 氨基酸铜配合物的模板合成 及其对质粒DNA的切割 中山大学化学与化学工程学院 2013年09月 http://ce.sysu.edu.cn/comlab/

2. 实验内容 实验1 氨酸铜配合物的合成和表征 • 模板合成 • IR光谱表征 • 自由基的UV光谱检测 实验4 DNA提取及其与氨酸铜配合物的作用 • 琼脂糖凝胶电泳 • 凝胶成像 总学时：15 学时 地点：丰盛堂212室

3. DNA结构及其断裂方式 自由基机理 自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏 酯水解机理 亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应 Ⅰ 超螺旋DNA Ⅱ 缺刻型DNA Ⅲ 线型DNA 酯水解机理优于自由基机理

4. DNA的自由基断裂 • 配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂 • 进一步在新的断裂处结合 • 断裂反应 • 互补链的断裂

5. 实验背景——模拟博莱霉素 在天然物质中，由5 个氨基酸、2 个六碳糖和1 个氨基侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。

6. 博莱霉素的活性中心 导致DNA链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。 CuP-3A的配位结构示意图

7. 博莱霉素的模型化合物 • Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. • Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292. Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH

8. 氨基酸铜化合物的合成路线

9. 模板反应的化学机理

10. 化合物1的红外光谱 (COO-) (NO2) (NO2) (COO-)

11. 化合物2的红外光谱 (NH2) (COO-) (COO-)

12. 氢氧自由基的形成和UV光谱检测 由于罗丹明B可与HO·迅速反应，并在553nm有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验HO·的生成。

13. 琼脂糖凝胶电泳 • 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 • 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 • 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 • 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等

15. 凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

16. 电泳缓冲液 • 常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) • TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 • TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解

17. 核酸电泳的指示剂 • 指示剂：溴酚兰、二甲苯青 • 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 • 二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当

18. 核酸电泳的染色剂——溴化乙锭 • 一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 • 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min • 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng • 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 ethidium bromide，EB

19. DNA断裂的凝胶电泳图 Ⅰ 超螺旋DNA Ⅱ 缺刻型DNA Ⅲ 线型DNA

20. 电泳实验装置 • 电泳仪（普通） • 电泳槽（水平平板） • 灌胶模具等

21. 电泳实验方法 • 洗净电泳槽，架好梳子 • 配制琼脂糖凝胶及倒胶 • 上样与通电 • 结果观察

22. 配制琼脂糖凝胶及倒胶 • 0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固。 • 向电泳槽中倒入0.5 × TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）

23. 上样与通电 • 在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内 • 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1 — 5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） • 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般 电泳条件为：电压 90V，时间 40min。

24. 结果观察和记录 • 紫外仪上观察电泳带及其位置 • 拍照 • 进一步使用软件对光密度进行分析

25. 合成实验要点 • 检查回流装置是否保持干燥 • 硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液 • 合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化，亮蓝色或紫蓝色为反应正常 • 实验中化合物合成与DNA断裂实验需交叉进行， DNA断裂所需的配合物由准备室提供 • 若硝基还原使用了较多溶剂，需使用旋转蒸发器除去多余溶剂 • 凝胶电泳照相需戴手套

26. 实验技术和方法 • 模板合成——大环化合物的合成方法（212室） • 旋转蒸发器——除去多余溶剂（212室） • 红外光谱——化合物结构表征 （210室） • 紫外可见光谱——跟踪罗丹明B与氢氧自由基的反应 • 凝胶电泳——切割DNA （317室） • 凝胶成像分析——检测DNA断裂状况（317室）

27. 实验要求 • 做好预习（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的IR特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等） • 实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重量、产率等） • 做好每一次测试，并打印结果 • 实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查 • 对实验结果作简要讨论 • 下一次实验提交本次实验报告 • 遵守实验规则，严禁违规操作，做好清洁值日

28. 参考书 （配位化学、生物无机化学、生物技术） • V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH verlag GmbH, 1999. • 计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，《生物无机化学》（第二版），中山大学出版社，2001。 • 杨频，高飞编著，《生物无机化学》，科学出版社，2002。 • F.奥斯伯， R.布伦特， R.E.金斯顿 等， 《精编分子生物学实验指南》，1998年6月第1版。