Supply-demand

1. Supply-demand Regulating the cellular economy of supply and demand Jan-Hendrik S. Hofmeyr and Athel Cornish-Bowden Hofmeyr JS, Cornish-Bowden A. (2000) FEBS Lett. 476:47-51.

3. Quanto è sensato considerare una via metabolica senza tener conto della richiesta di prodotto o del consumo di substrato? E’ quanto è stato fatto fino ad adesso… Suddividiamo la via in una parte che rifornisce ed una che consuma Cerchiamo di esaminare il comportamento della via metabolica prendendo in considerazione la richiesta di prodotto: Il prodotto P non viene più considerato come metabolita “esterno” Come saranno le espressioni delle velocità in funzione di [P] ? Presumibilmente iperboli rettangole (ma con asintoti orientati diversamente)

4. la pendenza della curva è la ε Rate characteristics: grafico vsupply in funzione di P Esempio di rappresentazione di una MM reversibile nello spazio lin e log (La formula è esattamente la stessa, cambiano solo gli assi!) v = 10*(1-P/1000)/(1+1+P) Vmax=10 Ks =1 S=1 Keq=1000

5. Combinando i grafici del demand e del supply posso trovare subito lo steady state (con i valori di J e [P]) Il comportamento delle velocità per supply e demand in funzione di [P] in scala logaritmica. In genere si tratta di blocchi di reazioni, non di singoli enzimi.

6. Vmax=15 Vmax=10 Aumentare la quantità di enzima (es. Vmax da 10 a 15) equivale a spostare la curva del Supply verso l’alto (senza cambiarne la forma). Al nuovo steady state il flusso aumenta di ΔlnJ1 L’entità della risposta del flusso e della [P] dipendono dalle pendenze delle curve e cioè da pvsupply epvdemand

7. Perturbiamo il sistema di una piccola quantità: aumentiamo la velocità del Supply (es. aggiungendo un poco di enzima) che passa da lnv a (lnv + dln v) Pss aumenta di dlnP, mentre J aumenta di dlnJ L’entità della risposta del sistema alla perturbazione dipende dalle ε …the response in the steady state to small perturbations in the activities of supply or demand depend completely on the elasticity coeffcients, i.e. the slopes of the tangents to the double logarithmic rate characteristics at the steady state point. εsupply è grande e εdemand piccola  la variazione di flusso sarà piccola e quella di P grande

8. Corrisponde a d ln(E) Aumento entrambi Aumento il demand Aumento il supply [P] rimane costante, J aumenta How the steady state (0) responds to a small increase dlnvin the activities of either supply (leading to a new steady state at 1)or demand (leading to a new steady state at 2) or both supply anddemand (leading to a new steady state at 3).

9. Se aumentiamo sia il Supply che il Demand di una quantità tale da tenere P costante, il flusso aumenterà di: dlnJ1 + dlnJ2 = dlnv Al nuovo steady state il flusso aumenta ([P] rimane costante) Teorema della somma per i CJ L’entità della risposta della [P] viene descritta mediante l’apposito coefficiente Cpsupply (coincide con la pendenza delle curve) Teorema della somma per i CS

10. Abbiamo sufficienti equazioni per risolvere il sistema? Teoremi della connettività per CJ e CP Risolvo il sistema: Attenzione: εvsupply rispetto a P è (generalmente) negativa 

11. Il rapporto Z tra le elasticità del Supply e del Demand determina dove risiede il controllo. Se , allora il demand ha maggior controllo. Analogamente per il demand: L’elasticità più piccola in valore assoluto conferisce un maggior controllo sul flusso

12. La distribuzione del controllo della concentrazione di P tra supply e demand è banale, mentre invece è interessante chi determina l’entità della variazione in P Quanto più grande è la somma tra le elasticità (εsupply è negativa!), tanto minore sarà CP ( basta che una delle due sia grande) Quando una delle due ε è grande, CP è piccola

13. εdem=0 εsupp=- Demand has complete control over flux As before; CpSupply =0 CpSupply =1/-εsupp Variazione in demand εdem=0 (il demand è saturato da P) |εdem|= |εsup| Variazione in [P] The steeper the slope of the supply characteristic, the narrower the band of variation in p and, therefore, the better the homeostatic maintenance of p The effect on the steady state of varying the demand (upperhalf) or supply (lower half). The slope ofeach line is an elasticity of either supply (s) or demand (d) at thesteady state. The dotted lines show a set percentage increase or decreasein activity. The shaded regions show the magnitude of the responsein the steady state flux (horizontal) and [P](vertical).

14. In B (εdem=0) sarà la demand ad avere il completo controllo sul flusso, mentre l’entità della variazione di P dipenderà solo da εsup “…the functions of flux and concentration control are mutually exclusive.” (nel senso che quando il controllo del flusso dipende solo dal demand, il controllo della [P] dipenderà solo dal supply; nei casi intermedi, entrambi influenzeranno sia CJ che CP) Nel caso C, εdem=0 e εsup= - . Che implica CPdem = 0 In questa situazione [P]ss non cambia anche cambiando la vdemand Se Cp = 0, allora l’aggiunta di enzima non cambia [P]!

15. εdem=0 e εsup= - Variazione in supply La variazione non è in Vmax!! Nel terzo caso, CPsup = 0, cioè l’aggiunta di enzima (supply o demand) non cambia [P]ss [P]ss cambia solo cambiando le caratteristiche dell’enzima (v. figura diapositiva successiva) perché è determinato unicamente da P0.5 (conc. di semisaturazione) del supply block ([P]in vivo>>> P0.5)

16. 3 2 1 Vmax=10 0 -5 -3 -1 1 3 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 Vmax=13 Un supply con Keq grande Un supply con Keq piccola La curva si sposta in alto, NON verso destra o sinistra Vmax=10

17. Se il εsup diventa 0? Supply has complete control over flux CpSupply =1/εdem Supply La ε del demand sarà l’unica cosa che determina l’entità della variazione di P. Questo NON vuole dire che variando il supply non vari [P] Variazione in J (o vsupp o vdem) εsupp=0 (il supply non è inibito da P) Demand Variazione in [P]

18. A good supply system: * Should meet increasing demand for product * Cope with low demand avoiding build up Textbook wisdom: allosteric feedback inhibition is responsible for satisfying demand and has little to say about low demand …when flux is controlled by one block, the other block determines to which degree the concentration of the linking metabolite is homeostatically maintained.

19. Senza inibiz a FB Vari livelli possibili di Demand Con inibiz. a FB Near eq. Near Kfb Solo in questa zona l’offerta può soddisfare variazioni nella domanda e, allo stesso tempo, mantenere la [P] ragionevolmente costante e bassa The steady state behaviour of a supply-demand system with(solid) and without (dashed) inhibition of supply by its product P.The grey lines represent different demand activities. Un esempio preso dalle piante: la biosintesi di Lisina

20. end-product feedback inhibition Supply Zhu X. and Galili G. (2003) Increased lysine synthesis coupled with a knockout of its catabolism synergistically boosts lysine content and also transregulates the metabolism of other amino acids in Arabidopsis seeds. The Plant Cell 15:845–853. PROTEIN SYNTHESIS Demand

21. 12-fold increase in seed free [Lysine] 5-fold increase in seed free [Lysine]

22. X wt DHPS Ht DHPS Hm Combinando le due strategie: - enzima biosintetico feedback resistant - eliminazione dell’enzima degradativo Si osserva un aumento di 80 volte in [Lys] libera nel seme (effetto sinergico) KO

23.  si verificano però problemi di germinazione… “significant enhancement of lysine levels specifically in developing seeds by genetic engineering also causes major problems associated with inefficient seed germination and plant growth.” (Kirma et al., 2012).  l’aumento di Lys è però meno impressionante quando calcolato sulla Lys totale, perchè la maggior parte della Lys è nelle proteine… “The relative Lys content in this extract was 4.3-fold higher in the LKR/ SDH knockout X phaseolin-DHPS plants than in wild-type plants” Approccio simile nell’endosperma di mais (Huang et al.): Seed-specific expression of a bacterial Lys-insensitive DHDPS and seed specific suppression of LKR/SDH with RNAi. >40-fold increase in seed free [Lysine]

24. Enzyme concentr. (e1) Role of enzyme parameters E1 kinetics (h, p0.5) E1 kinetics () Pathway thermodynamics (/Keq)

25. Il grosso problema inizia quando il demand scende sotto questa soglia Regimes of flux-control

26. Catabolic demand acts as an overflow valve Aggiungiamo un catabolismo la cui “Km” è più grande della Ki dell’inibizione

27. Quando il demand è alto, il flusso catabolico è irrilevante

28. The presence of allosteric feedback inhibition is not a prerequisite for flux control by demand, but there is a dramatic difference between the two situations: the concentration of P. * Without FB it can only be near equilibrium ( svantaggi …) * With FB inhibition can be orders of magnitude far from eq. ( P05) Kinetic effects such as FB inhibition can only play a regulatory role far from equilibrium (effect on the thermodyn. term in the elasticity). Non fate di necessità virtù! Gli enzimi che catalizzano reazioni con un G grande devono essere ben regolate per evitare gli eccessi di metaboliti (troppo o troppo poco) per cui la regolazione non è una virtù, è una necessità. (Necessity is the mother of invention!) L’inibizione a feedback va proprio incontro a questa necessità.

29. Catabolic block Anabolic block Growth block Provides building blocks (aa, nucleotides…) Uses building blocks (aa, nucleotides…) or power (NADPH & ATP) to make and mantain cells Provides phosph. & reducing power (ATP, NADPH) and carbon skeletons Questi diversi blocchi sono “collegati” tramite diversi metaboliti. Flux is largely controlled by demand Molte evidenze sperimentali: glicolisi (…), Km per aminoacyl-tRNA sintetasi (1 ordine di grandezza più piccole delle [aa] Km per enzimi di degradazione “Rate limiting steps” catalysed by allosteric enzymes have actually nothing to do with flux control, but are responsible for the homeostasis of metabolites.

30. Referenze Hofmeyr JH, Cornish-Bowden A. (2000) Regulating the cellular economy of supply and demand. FEBS Lett. 476:47-51. Review. Hofmeyr, J.H. and Rohwer, J.M. (2011) Supply-demand analysis a framework for exploring the regulatory design of metabolism. Methods Enzymol. 500:533–554. Rohwer, J.M. and Hofmeyr, J.H. (2008) Identifying and characterising regulatory metabolites with generalised supply-demand analysis. J. Theor. Biol. 252:546–554. Catabolismo della lisina: Zhu X. and Galili G. (2003) Increased lysine synthesis coupled with a knockout of its catabolism synergistically boosts lysine content and also transregulates the metabolism of other amino acids in Arabidopsis seeds. The Plant Cell 15:845–853.