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细菌内毒素检查技术 讲 义

细菌内毒素检查技术 讲 义. 北京毕特博生物技术有限责任公司 2007 年 9 月. 目 录. 一、细菌内毒素检查的基础理论 -------------3 二、 BET 试验前的准备 ------------------------24 三、细菌内毒素检查的实验技术 -------------28 1 ，鲎试剂灵敏度复核 -------------------------33 2 ，干扰初筛试验 ------------------------------40

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细菌内毒素检查技术 讲 义

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  1. 细菌内毒素检查技术讲 义 北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月 Bitab

  2. 目 录 一、细菌内毒素检查的基础理论-------------3 二、 BET试验前的准备------------------------24 三、细菌内毒素检查的实验技术-------------28 1，鲎试剂灵敏度复核-------------------------33 2，干扰初筛试验------------------------------40 3，干扰试验------------------------------------49 4，检查法---------------------------------------62 四、细菌内毒素检测技术的发展 Bitab

  3. 一、细菌内毒素检查的基础理论 1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识 Bitab

  4. 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应 致热性 耐热性 需要在250摄氏度干热至少30~60分钟才能彻底灭活 分子极性 多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性， 在水中呈不均匀分布 酸碱性 与强酸强碱水解反应 与鲎试剂反应 与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶 1、细菌内毒素1）化学成分及特性 -- 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 -- 是高分子量脂多糖复合物（LPS） 除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性 （1）特性 Bitab

  5. （2）化学结构 -- 含有3个截然不同的区域 ◆O- 特异侧链 ◆核心多糖 ◆类脂A 内毒素的分子结构 Bitab

  6. 2） 内毒素与热原的关系 -- 内毒素是热原之一种-- 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。 3）标准内毒素和环境内毒素1）标准内毒素 经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。2）环境内毒素 天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。 Bitab

  7. 4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备 1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，其他国家药典都有类似要求 -- 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 Bitab

  8. 2、鲎试剂 1）鲎试剂的分类 -- 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） -- 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 -- 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂 Bitab

  9. 2）鲎试剂的规格 -- 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂） -- 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂 -- 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。 Bitab

  10. 3）鲎试剂的质量标准 -- 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml -- 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应 -- 缓冲能力 -- 干燥失重 -- 无菌：中国标准无此项要求 Bitab

  11. 内毒素 4）鲎试剂与内毒素的反应机理 二价阳离子 β葡聚糖或LAL-RM 活化的C因子 C因子 活化的G因子 G因子 B因子 活化的B因子 凝固酶原 凝固酶 （酶作用物） AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH pNA （对硝基苯胺 黄色） 405nm测吸光度值 Bitab

  12. 3、BET用水 • 2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 • 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素含量应少于0.005EU/ml。 • 美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。 Bitab

  13. 4、BET程序 灵敏度的复核试验 1）验证实验 • 凝胶法 • 光度测定法 2）检查法 • 凝胶法 • 光度测定法 动态法终点法：终点比色法试验 干扰试验 标准曲线可靠性试验 干扰试验 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 动态比浊法试验 动态比色法试验 动态终点法 Bitab

  14. 5、《中国药典》2005年版细菌内毒素检查法 1）综述部分 • 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 • 内毒素标准品及检查用水 • BET器具的要求 • 供试品溶液的要求 • 内毒素限值的确定 • 最大有效稀释倍数的计算 Bitab

  15. 2）试验部分 （1）凝胶法 • 鲎试剂灵敏度复核试验 • 干扰试验 • 检查法 （2）光度测定法 • 标准曲线的可靠性试验 • 干扰试验 • 检查法 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 3）2005年版药典BET法际验部分主要内容 Bitab

  16. Bitab

  17. 6、相关参数的计算 1）内毒素限值 （1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性单位)表示； K为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5 EU/(kg·h),放射性药品注射剂K=2 EU/(kg·h),鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h), M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)、 U/(kg·h)表示，人均体重按60Kg计算，注射试剂若不足1小时，按1小时计算。 Bitab

  18. （2）内毒素限值计算举例 -- 注射用的头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次 L= =0.20EU/mg -- 注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0至8.0g，分3至4次给药，一日最高剂量不超过12g L= =0.075EU/mg -- 对于大输液（LVP）,美国药典（USP）通常都取L值为0.5EU/ml 5 EU/(kg·h) 1500 mg/(60kg·h) 5 EU/(kg·h) (12000mg/3) / (60kg·h) Bitab

  19. 2）最大有效稀释倍数 -- 供试品最大有效稀释倍数（MVD）按以下公式计算 MVD=CL/λ C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml;当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位为mg/ml或 U/ml。凝胶发中，λ为鲎试剂的灵敏度 光度测定法中，λ为标准曲线最低浓度 -- 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠（浓度为10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为 MVD= =8 (倍) 10mg/ml x 0.2EU/mg 0.25EU/ml Bitab

  20. 3）最低有效稀释浓度(MVC) -- MVC=λ/ L -- 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠的最低有效浓度为 MVC= = 1.25mg/ml 4) 样品稀释过程中加液量的计算 -- 稀释过程中，假设从溶液S1取（x）ml溶液稀释（n）倍至S2，加液量为（y）,则满足： y= (n-1) X x -- 如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液量为： y=(3.8-1) X 0.5=1.4ml 即0.5ml的S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S2 0.25EU/ml 0.20EU/mg Bitab

  21. 7、试验相关知识 1) 内毒素标准品的使用 （1）复溶 • -- 复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液再混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。 • 复溶液的体积一般为1ml,或根据使用说明书加液。 （2）效价 • -- 厂家必须向用户提供一份效价分析证书（Certificate of Analysis,CoA） • 效价分析证书应注明：RSE/CSE ____EU/mg; _____ng/瓶 Bitab

  22. 2) 鲎试剂的使用 -- 使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其大道室温温度鲎再复溶使用 -- 复溶鲎试剂鲎，应避免强烈振动产生泡沫 -- 由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阳性 3）内毒素的清除 （1） 冲洗 • 适用于器械组件、塞子等 • 可用于加热等方法提高清除效率 （2）蒸馏，折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽状态逸出 （3）反渗透 （4） 超滤 （5）活性炭吸附 Bitab

  23. 4）内毒素的灭活 （1） 酸/碱水解 （2）氧化 -- H2O2 （3）干热 -- 250℃，>30分钟的干烤 Bitab

  24. 二、BET试验前的准备 1. 在细菌内毒素检查试验中，凡是与试验样品或试剂接触的器具必须经过除热原处理。 • 玻璃器皿一般用洗液浸泡4小时后，用自来水冲洗，再用真馏水冲洗、晾干。最后在280℃干烤至少120分钟。 Bitab

  25. 2. 试验所试用的器具主要包括有： 无热原稀释管 无热原玻璃移液管 无热原玻璃毛细管 稀释试管架 安瓿试管架 反应试管架 可调移液器 连接胶粒 无热原吸头 安瓿开启器 70%的异丙醇浸泡的无纺布拭布 Bitab

  26. 3. 实验中也可用一次性的无热原塑料器械。 如用可调移液器和无热原吸头代替无热院玻璃移液管取液等。 在使用可调移液器连接无热原毛细管吸取微量溶液时，采用多吸少打方式。避免由于毛细管的虹吸作用带来的加样误差；也可避免微量加样时产生气泡。 Bitab

  27. 4. 细菌内毒素检查实验的恒温反应在37℃的恒温器中进行。 TAL-40型试管恒温仪（安度斯设计生产），专门用于细菌内毒素检查的恒温仪器。具有 A, 温度稳定； B, 加热均匀； C, 定时报警等特点 Bitab

  28. 三、凝胶法细菌内毒素检查技术 1，凝胶法BET试验程序 2，试验器具 3，鲎试剂灵敏度复核 4，干扰初筛试验 5，干扰试验 6，检查法 Bitab

  29. 1、凝胶法BET的实验程序 1）试验准备：试剂、仪器及实验用具等 2）确定供试品的内毒素限值（L） 3）选择鲎试剂（λ） 4）计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度（MVC） 5）鲎试剂灵敏度复核 6）供试品干扰初筛试验（建议试验） 7）供试品干扰验证试验 8）供试品日常检查 Bitab

  30. 2、试验器具 1）器具的要求及处理--玻璃器皿需除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后>250℃至少干烤1小时 --塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 --首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具 2）孵育反应仪器 • 温度精确：37±0.2 ℃ • 发热均匀：<0.1 ℃ • 可定时提示：0至90分钟可设定定时蜂鸣提示 • 试管免封口 Bitab

  31. 3 、鲎试剂灵敏度复核试验 1）鲎试剂灵敏度复核实验目的1）验证实验室的条件是否满足BET实验的要求2）验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求 3）验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET用水等）是否满足BET实验的要求 2）鲎试剂灵敏度复核实验的步骤1）恒温仪器预热2）C溶液（标准内毒素溶液）的制备3）鲎试剂制备4）加样及恒温反应5）结果判断6）数据处理 Bitab

  32. 3）操作步骤示意图 RSE或CSE 鲎试剂TAL BET水复溶 BET水复溶 混匀 混合 旋涡混合器混合15min 轻轻转动瓶壁摇匀 单次管：原安瓿 多次管：反应试管 稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液 每步稀释于旋涡混合器混合30s C溶液反应：0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管 D溶液反应：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管 混匀（水浴恒温需封口） 37℃±1℃，60min±2min Bitab

  33. 4）灵敏度复核试验举例 (1) 试剂 Bitab

  34. BET水 2.0ml 1.0ml 3.6ml 3.6ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 0.4ml 0.4ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml CSE 30s 30s 5min 30s 30s 30s 0.125EU/ml 100EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.06EU/ml 0.25EU/ml （2）实验前，将恒温仪器预热至37℃ （3）标准内毒素溶液（C溶液）的制备 Bitab

  35. （4）鲎试剂的准备取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：（4）鲎试剂的准备取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列： 用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解 阴性对照溶液D 0.25EU/ml 0.5U/ml 0.06EU/ml 0.125EU/ml Bitab

  36. 0.06EU/ml NC CSE 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TAL 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml （5）加 样 用精确移液器分别吸取0.1ml的0.06EU/ml、 0.125EU/ml、 0.25EU/ml、0.5EU/ml的标准内毒素溶液，加入已复溶的鲎试剂中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照。 加样顺序一般从低浓度到高浓度 Bitab

  37. （6）恒温反应 --- 将加样完的混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入37±1℃ 的恒温器中孵育60±2分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成） ---若保温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染。的混合液需封口后再将其放入水浴中恒温反应 Bitab

  38. － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ 阳性 阴性 （6）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“＋”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。 结果判断：反应管缓缓倒转180º 阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者 阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者 实验符合要求的基本条件： NC管全部阴性 （－－） 2λ管全部阳性 （＋＋＋＋） 0.25λ管全部阴性 （－－－－） Bitab

  39. 平行 管 C溶液(EU/ml) D溶液 反应终点浓度 X （lg反应终点浓度） 0.5 0.25 0.125 0.06 1 ＋ ＋ ＋ － － 0.125 －0.903 2 ＋ ＋ － － － 0.25 －0. 602 3 ＋ ＋ － － － 0.25 －0. 602 4 ＋ ＋ － － － 0.25 －0. 602 （7）数据处理 λc =lg-1（ΣX/4） =lg-1{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0. 602)＋(－0. 602)]/4} = 0.210EU/ml 即在本批号鲎试剂的复核灵敏度（ λc）为0.21EU/ml 药典要求：λc在0.5λ～ 2.0λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度值。 结论：本批TAL的灵敏度标示值符合规定，按标示值使用! Bitab

  40. 4、干扰初筛试验 1）目的及原理： --本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度。 --本试验可减少干扰试验的盲目性 2）试验步骤 ①供试品限值的确定 ②供试品最大有效稀释倍数的确定 ③试剂的选择 ④反应溶液的制备 ⑤加样及反应 ⑥结果判断 Bitab

  41. 3) 干扰初筛试验举例 （1）供试品限值 ---硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； ---药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U （2）最大有效稀释倍数的确定 ---最大有效稀释倍数MVD=cL/λ； ---使用λ=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时， MVD0.5=——————————— =20 倍 ---由此可计算出使用不同λ时所对应的MVD: 20000U/ml x 0.5EU/1000U 0.5EU/ml Bitab

  42. ---由此可计算出使用不同λ时所对应的MVD: （3）试剂 Bitab

  43. （4）各反应溶液的制备 Bitab

  44. 溶液C: E 2  0.4ml 0.4ml 0.5ml • 溶液C的制备 E100 E10 E1 E0.5 • 溶液A的制备 S原液S10 S20 S40 S80 S160 S320 3.6ml W 3.6ml W 0.5ml W 0.4ml 1.4ml 1.4ml 1.4ml 3.6ml W 1.4ml W 1.4ml W 1.4ml W 1ml 1.4ml 溶液A 1.4ml W 1ml W Bitab

  45. 溶液B的制备 E1 E1 E1 S20 E0.5 S40 E0.5 S80 E0.5 S10 S20 S40 E1 E1 S160 E0.5 S320 E0.5 S80 S160 注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml Bitab

  46. （5）加样及反应 ◇用移液器准确吸取0.1mlBET水将鲎试剂复溶 ◇取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管 ◇另外取0.1mlBET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管 Bitab

  47. （4）结果判断 - - - - - - - - - - - - - + + + + + - + + + + + Bitab

  48. --当溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性时，试验有效。--当溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性时，试验有效。 --溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为≤S40 Bitab

  49. 5 、干扰试验 -- 通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。 -- 至少对3批样品进行干扰试验。 1）试验步骤： -- 供试品限值的确定。 -- 鲎试剂的选择 -- 最大有效稀释倍数的确定 -- 反应溶液的制备 -- 加样及反应 -- 结果判断 Bitab

  50. 何种情况下要做干扰试验？——干扰试验是一个验证实验何种情况下要做干扰试验？——干扰试验是一个验证实验 • 新品种建立BET方法 • 鲎试剂的来源改变 • 鲎试剂的配方、生产工艺改变 • 供试品的来源改变 • 供试品的配方、生产工艺改变 • 试验环境中发生了其它任何有可能影响试验结果的变化 Bitab

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