大肠杆菌杂交系统及应用 演讲人：冯燕丽

1. 大肠杆菌杂交系统及应用 演讲人：冯燕丽 2003年4月25日

2. 原理 • 依赖转录激活过程； • 报告基因的表达水平与bait（已知蛋白）与 target （已知蛋白）蛋白间作用强度呈正相关性； 双杂交系统：筛选已知相互作用的蛋白 或与特定蛋白作用的未知蛋白 生化方法：需要纯化蛋白或抗体

3. 方法 材料：bait、target载体 报告细胞 其他必要因素 要求：bait载体，pBT , 3.1kb,编码全 长细菌噬菌体cl蛋白 target载体,pTRG, 4.3kb,控制 RNA 多聚酶 亚基和连接区的转录 报告细胞,XL1-Blue MRF’,无任何限制系统,与cDNA文库建立方法兼容

4. 已知蛋白(bait)  全长细菌噬菌体蛋白cI cI（N-端DNA结合区和C-端二硫基） 结合位置：在操纵子序列的上游 目标蛋白（target）RNA 多聚酶 亚基N-端 报告细胞中进行: bait  target 作用后启动两个报告基因ampr、lacZ 具体: bait与 target作用时，其恢复和稳定RNA 多聚酶 启动子的结合，激活报告基因（AmpR）转录 ； 报告基因 半乳糖苷酶基因，同一启动子，通过 可见的表型变化来证实bait与 target间的相互作用

5. 另一系统 • 依赖信号转导途径的重建； • 利用两蛋白间的作用导致片断间的功能性互补，从而引起cAMP 合成。cAMP再激活分解代谢操纵子（乳糖或麦芽糖）转录，产生可见的特征性的表型变化。

7. 材料：DHP1 （E.coli cya菌株，腺苷酸环化酶缺失型） 表达载体pCm-AHL1 pT25p、pT18(含两个互补片断T25、T18，组成 Bordetella pertussis腺苷酸环化酶的媒触区）

8. 方法： 1、设计功能互补的CyaA的T25和T18片断； pT25p、pT18共转DHP1； 在加入maltose 中培养； 检测：全表达呈红色，不表达呈白色 2、用功能互补反应在体内检测蛋白间作 用

10. 表1 Analysis of complementation in DHP1 strain Plasmids Phenotype on MacConkey/maltose None white pCm-AHL1 red/24hr pT25pT18 white/72hr pT25pT18-zip white/72hr pT25-zippT18 white/72hr pT25-zippT18-zip red/24hr

11. 表2 Complementation between various chimeric protein Plasmids Phenotype on MacConkey/maltose pT25-TyrpT18 -Tyr red/40hr pT25 -Tyr pT18 white/96hr pT25pT18 –Tyr white/96hr pT25-Tyr pT18 white/96hr pT25-zippT18 –Tyr white/96hr pT25-prp11pT18 –prp21 red/40hr 说明：互补受整合到T25、T18的多肽的特异性识别控制 嵌合蛋白的互补作用也依赖其配体的特定性作用

13. 结论 • 优势：与酵母双杂交系统的比较 传统酵母双杂交系统 BacterioMatch双杂交系统 生长时间 6天 1天或过夜培养 转化率 106 109 DNA操作过程 额外转化过程到E.coli 直接克隆筛选 DNA分离 酵母染色体DNA与质粒共沉淀 简单、方便的制备 （去除了一步转化） 克隆分析 繁琐的纯化后进行 直接进行 结果评价 假阳性多 假阳性少 * 决定细菌杂交系统能更灵敏检测难发现特定蛋白结合体 对待测蛋白的特性要求低，因此可适合更大蛋白库筛选

14. 应用 • 用于研究蛋白-DNA、蛋白-蛋白间相互作用

18. Thank a lot!