生物大分子相互作用 çš„ç ”ç©¶æ–¹æ³•

1. 生物大分子相互作用的研究方法 三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn

2. 世界上只有一种疾病，那就是——基因表达异常Roger J. Williams(Nutrition Against Disease: Environmental Prevention 1971)

3. 核酸和蛋白质是生物体内重要的生物活性大分子，各自有其结构特征和特定功能，是生命活动的主要组成部分。核酸和蛋白质是生物体内重要的生物活性大分子，各自有其结构特征和特定功能，是生命活动的主要组成部分。 两者的相互作用构成了诸如生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动。 HGP完成之后，大量的基因被发现和定位，基因功能的研究成为分子生物学研究的中心问题之一。

4. 基本转录复合物 转录因子与特定DNA元件结合启动转录 蛋白质—核酸

5. 染色质结构与基因表达

6. 蛋白质和核酸的相互作用——参与了很多体内的生物学过程，弄清DNA-蛋白质相互作用的机制，对我们了解DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。 蛋白质和蛋白质间的相互作用——蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，每个蛋白质并不是独立地行使其功能，它们在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能 。

7. 蛋白质—蛋白质相互作用传递信息 EGF信号传导通路 蛋白质—DNA相互作用产生效应

8. DNA-蛋白质相互作用的研究方法

9. 蛋白质和核酸的相互作用参与了很多体内的生物学过程，弄清DNA-蛋白质相互作用的机制，对我们了解DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。

10. http://www.piercenet.com/method/methods-detecting-protein-dna-interactionshttp://www.piercenet.com/method/methods-detecting-protein-dna-interactions

11. 研究DNA-蛋白质相互作用的技术有很多，包括：研究DNA-蛋白质相互作用的技术有很多，包括： DNase I足迹试验 电泳迁移率变动实验(EMSA) 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术（ChIP） ChIP-Sequence技术 甲基化干扰试验 噬菌体展示技术 核酸适体技术 等等。

12. 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 1. DNase I足迹试验

13. DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有DNase I足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，两者原理基本相同。

14. DNase I足迹试验的实验流程如下： 待检双链DNA分子用32P作末端标记，通常只标记一端； 蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNase I，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照； 从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。

15. 精确控制酶量

16. Actual experimental results. Lanes 1–4 contained DNA bound to 0, 10, 18, and 90 pmol of protein, respectively (1 pmol = 10–12 mol). The DNA sequence was obtained previously by standard dideoxy sequencing.

17. 电泳迁移率变动实验(electrophoresis mobility shift assay , EMSA)又称凝胶阻滞实验，是一种简单、快速和灵敏的体外检测DNA 与蛋白质相互作用的技术。 2. 电泳迁移率变动实验

18. 基本原理——在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了，导致在聚丙烯酰胺凝胶电泳上发生阻滞，形成滞后带。

19. EMSA

20. Nuclear extract of non-activated cells Nuclear extract of activated cells Radioaktively labeled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe) and bound NF-B NF-B Radioactively labeled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe) Free Probe A double-stranded oligonucleotide containig a NF-B- binding site is labeled with a radioactive isotope and incubated with a nuclear extract. During gel-electrophoresis, NF-B bound to the oligonucleotide causes a shift compared to the free probe.

21. EMSA的主要实验步骤： 探针制备(设计、合成、标记、纯化、退火) 具体实验设计 核蛋白(?)制备及浓度测定 EMSA操作 实验时竞争设计!

22. 凝胶阻滞试验一定要排除非特异结合。其方法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA/冷探针)。 如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。 探针突变？

23. 抗体超迁移检测（antibody supershift assay）是在凝胶阻滞实验的基础上进一步发展而来。在DNA-蛋白质结合反应体系中加入抗目的DNA结合蛋白质的特异抗体。由于抗体的结合，使DNA-蛋白质-抗体的分子量增加，DNA-蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率进一步降低，出现“超迁移带”。

26. EMSA技术是一种简单和灵敏的检测DNA-蛋白质相互作用的技术，但它不能发现新的DNA-蛋白质的相互作用。（只能验证！）EMSA技术是一种简单和灵敏的检测DNA-蛋白质相互作用的技术，但它不能发现新的DNA-蛋白质的相互作用。（只能验证！） 酵母单杂交技术不仅能验证和检测已知的DNA-蛋白质相互作用，还能筛选、发现新的DNA-蛋白质相互作用。 3. 酵母单杂交yeast one-hybrid system

27. 1993年建立以来，应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。1993年建立以来，应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。

28. 基本原理——真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。 BD有特异性 AD没有特异性（可独立起作用）

29. 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TF IID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。

30. 据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。

31. Element • 该系统需包含： • 文库蛋白的编码基因与GAL4 转录激活域融合表达的cDNA 文库质粒； • 含目的基因与下游报告基因的报告质粒。 • 其中，文库的设计和筛选实验是整个酵母单杂交系统的核心技术。

32. 元件串连四聚体插入报告基因质粒

33. AD cDNA文库质粒载体

34. 构建含有元件核心序列的报告基因质粒 双重报告基因菌株构建 将报告基因质粒整合到YM4271菌株 检测各种报告基因的背景表达 利用双重报告基因菌株筛选文库 MATCHMAKERcDNA文库的扩增 阳性克隆的分离与鉴定 筛选所得阳性质粒测序及BLAST分析

35. 酵母单杂交体系主要有以下3种用途： 确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用； 分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因； 定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

36. 染色质免疫沉淀技术(chromatin immuno-precipitation assay, ChIP) 是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 4. 染色质免疫沉淀技术(ChIP)

37. 染色质免疫沉淀技术基本原理在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀技术基本原理在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

38. 染色质免疫沉淀技术一般包括： 细胞固定 染色质断裂 染色质免疫沉淀 解交联反应 DNA的纯化 DNA的鉴定

39. 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质 ChIP

40. ChIP 流程图

41. ChIP-chip技术 Biotechniques. 2007 December ; 43(6): 791–797.

42. ChIP-Seq技术是将染色质免疫共沉淀获得的微量DNA片断进行大规模测序。通过免疫共沉淀得到目的DNA（> 10ng, 200bp左右），将获得的DNA片段加上接头后进行PCR扩增，得到 ChIP- Seq 文库后直接进行大规模测序。ChIP-Seq是继ChIP-ChIP后，蛋白/核酸相互作用研究的又一技术突破。实现了全基因组范围内更精确、更敏感、更经济的定位目蛋白所有的结合位点。 5. ChIP-Seq技术

43. 主要步骤 常规的染色质免疫沉淀(ChIP)技术，获得目的DNA片段； DNA片段的末端修复，将 ‘A’ 碱基加入到 DNA片段的3‘末端； DNA片段末端加上接头； PCR扩增加上接头的DNA片段； DNA在Cluster Station成簇扩增； Illumina Genome Analyzer上的测序； 生物信息学分析。

45. 染色质免疫共沉淀 ↓ 目的DNA片段 ↓ DNA片段的末端修复 ↓ 将 ‘A’ 碱基加入到 DNA片段的3‘末端 ↓ DNA片段末端加上接头 ↓ PCR扩增加上接头的DNA片段 ↓ 文库检测 ↓ DNA在Cluster Station成簇扩增 ↓ Illumina Genome Analyzer上的测序 ↓ 生物信息学分析

46. 蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法

47. 蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，每个蛋白质并不是独立地行使其功能，它们在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能。因此，后基因组时代的一个研究热点就是探索蛋白质-蛋白质的相互作用及其在调控各种生命活动中的作用。

49. 研究蛋白质—蛋白质相互作用的技术有很多，包括：研究蛋白质—蛋白质相互作用的技术有很多，包括： GST融合蛋白进行Pull down实验 免疫共沉淀（Co-IP）技术 酵母双杂交 Co-IP—质谱 蛋白质芯片技术 荧光能量转移技术 噬菌体展示技术 等等

50. 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 1. GST融合蛋白进行Pull down实验